肠道菌群代谢产物氧化三甲胺参与静脉血栓形成的初步研究

发布时间：2020-10-13 20:59

　　 第一部分氧化三甲胺对内皮细胞组织因子凝血途径的影响目的:观察氧化三甲胺(trimethylamine N-oxide,TMAO)对内皮细胞表达组织因子及组织因子途径抑制物的影响方法:采用CCK-8法评价TMAO对原代内皮细胞存活率的影响;实时荧光定量PCR检测TF及TFPI的表达;Western blot测定TF抗原及TFPI抗原水平;发色底物法检测TF的活性水平。结果:在0-400μM的浓度范围内,TMAO对内皮细胞的存活无明显影响;TMAO促进TF m RNA、TF抗原的表达,并呈剂量及时间依赖性,分别在400μM TMAO作用后4h及8h达高峰;TMAO能增强TF的促凝活性;TMAO对TFPI m RNA及抗原表达无明显影响。结论:TMAO对内皮细胞TF表达有诱导作用,对TFPI的表达无明显影响。第二部分氧化三甲胺调节内皮细胞组织因子表达的机制研究目的:进一步探讨TMAO能诱导内皮细胞TF表达的信号转导机制方法:原代细胞培养采用ECM培养基;实时荧光定量PCR检测TF mRNA水平;Western blot测定NF-κB、MAPK p38、ERK、JNK、c-jun的蛋白磷酸化水平;免疫荧光法检测NF-κB在细胞内的定位;发色底物法检测TF的活性水平。结果:TMAO使IκB-α含量减少,使NF-κB p65、c-jun、MAPK p38、ERK、JNK磷酸化水平增多;TMAO使NF-κB p65发生由细胞质向细胞核内的转位;TMAO对TF m RNA及活性的诱导效应可以被NF-κB及c-jun抑制剂逆转。结论:转录因子NF-κB及c-jun介导了TMAO对内皮细胞TF表达的诱导作用,并可能受到上游MAPK信号转导通路的调控。第三部分氧化三甲胺对小鼠深静脉血栓形成的作用研究目的:观察血浆高TMAO水平对小鼠静脉血栓形成的直接影响方法:分别使用高胆碱饲料及基础饲料喂养C57BL/6J小鼠8周,高效液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)检测小鼠血浆TMAO水平;剪尾法对小鼠出血时间进行测定;ELISA法检测小鼠血浆凝血酶-抗凝血酶复合物(thrombin-antithrombin complex,TAT)水平;下腔静脉狭窄法评估小鼠血栓形成能力。结果:以不同饲料喂养8周后,高胆碱组小鼠与对照组小鼠血浆TMAO水平分别为21.40±2.65μM及3.04±0.77μM,差异有统计学意义(p0.001),而小鼠体重、肝肾功能、血糖、血脂等指标无明显差异;与正常饮食的小鼠相比,高胆碱饮食使小鼠出血时间轻微缩短,血浆TAT水平升高,且下腔静脉结扎法形成的静脉血栓模型中形成的血栓较大。结论:高胆碱饮食造成的血浆TMAO水平升高能在一定程度上激活体内凝血过程,对静脉血栓的形成具有促进作用。第四部分氧化三甲胺与静脉血栓形成的关联研究目的:研究血浆TMAO水平及FMO3基因多态性与静脉血栓形成的关联方法:建立静脉血栓组及健康体检组的生物样本库;LC/MS法对两组人群血浆TMAO含量进行测定;竞争性等位基因特异性PCR(Kompetitive Allele Specific PCR,KASP)技术对TMAO的代谢酶FMO3编码基因上的rs1736557、rs2266782、rs2266780三个多态性位点进行基因分型。结果:LC/MS法检测静脉血栓组与对照组血浆TMAO浓度分别为:8.77±4.81μg/L及6.50±4.07μg/L,差异具有统计学意义(p=0.026);KASP技术对rs1736557、rs2266782、rs2266780的检出率分别为96.75%、98%、97.75%,rs2266782、rs2266780多态性与静脉血栓形成无明显相关性;rs1736557中A等位基因是静脉血栓形成的保护性因素,在加性模型及隐性模型中,OR值分别为0.32(95%CI 0.11-0.92,p=0.027)及0.34(95%0.12-0.96,p=0.033)。结论:血浆TMAO升高可能是静脉血栓形成的危险因素;FMO3基因rs1736557位点A等位基因是静脉血栓形成的保护性因素,该结论有待进一步研究验证。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R543.6
【部分图文】：

计量资料符合正态分布且满足方t）进行统计，符合正态分布而方差不齐的计hitney U test)进行统计。所有统计分析都统计学分析都采用双侧检验，检验水准 α 设结 果活率的影响评价 TMAO 对内皮细胞的毒性，根据各组吸性，结果如下图 1 所示，在 0-400μM 的浓不具有统计学意义（p>0.05，n=4）。

图 2.定量 PCR 熔解曲线2.1 不同浓度 TMAO 对 HUVEC 表达 TF mRNA 水平的影响如图 2.1 所示。可见受TMAO 的刺激时，细胞 TF mRNA 水平有所升高，且升高的水平具有浓度依赖性，100μM 的浓度开始，TMAO 对内皮细胞 TF mRNA 表达的促进作用具有统计学差异400μM 的 TMAO 表现出的刺激作用最强，约是基础水平的 1.84 倍，效果与 1g/ml LPS 的刺激作用相当。以 400μM 的 TMAO 浓度作用于 HUVEC 细胞，TF mRNA 水从作用后 1h 开始升高，4h 时达峰值，随后开始下降但仍较基础表达高。这种促进用可维持 24h。各时间点 TF mRNA 水平与基础水平的差异均具有统计学意义（p<0.0

a. 不同浓度 TMAO 对 TF mRNA 的影响，与对照组相比，*p<0.0MAO 作用不同时间对 TF mRNA 的影响, 与对照组相比，*p<0.
【参考文献】

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本文编号：2839699