TET2缺失导致红系祖细胞功能异常的机制研究

发布时间：2020-11-02 04:36

　　 研究背景和目的:红细胞生成指造血干细胞在造血微环境中,通过细胞的自我更新、增殖、定向分化和脱核等重要的生物学事件,最终产生成熟红细胞的过程。由于红细胞生成紊乱或无效造血而引起的贫血是多种人类血液病重要的临床表现,其中包括骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic syndromes,MDSs)。MDSs是造血干祖细胞克隆发生异常的髓系疾病,主要特征是骨髓造血功能缺陷和髓内细胞凋亡。而MDSs患者突变频率最高的的基因是DNA双加氧酶2(Ten-Eleven-Translocation 2,TET2),其功能是把5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,5-mC)转变为5-羟甲基胞嘧啶(5-hydroxymethylcyosine,5-hmC),从而参与DNA去甲基化过程,影响靶基因转录和表达。目前,关于TET2突变MDSs患者的红系异常的分子机制仍不清楚。本课题组已报道,TET2敲低引起c-Kit和AXL介导的红系祖细胞的克隆性增殖,从而出现功能异常Marker-CFU-E(M-CFU-E)细胞。我们进一步研究发现M-CFU-E细胞不仅异常增殖,也发生大量的凋亡。因此,本研究主要是在体外红系培养发育体系以及血液肿瘤细胞系中敲低TET2的表达,以期揭示TET2调控红系祖细胞凋亡的分子机制,为TET2突变的MDSs疾病相关的凋亡机制提供新的视角,也为治疗MDSs疾病提供新的科学依据。研究方法:首先,我们选用CD34~+磁珠在脐带血的单个核细胞中分离纯度为95%以上的造血干细胞CD34~+,转染携带TET2-shRNA的慢病毒,采用嘌呤霉素(Puromycin)进行筛选,利用qRT-PCR方法,检测TET2敲低效率并成功获得TET2敲低细胞。在体外红系培养体系中,运用流式细胞技术分选出正常组和TET2敲低组红系祖细胞之后,通过流式细胞分析技术检测两组细胞分化和凋亡,通过甩片观察其形态。其次,为明确其相关凋亡分子,我们分选出Luciferase CFU-E和M-CFU-E两组细胞,进行转录组测序(RNA-seq),运用生物信息分析的方法,明确TET2敲低后的差异基因和凋亡相关信号通路;为了验证其表达差异,运用qRT-PCR和流式细胞技术同时检测了TET2敲低型细胞中凋亡相关分子(FAS,Fas Cell Surface Death Receptor)的表达。为进一步探讨TET2敲低引起FAS上调的分子机制,我们通过糖基化和限制性内切酶的处理方式,检测并分析FAS启动子区关键CCGG位点的5-mC和5-hmC的差异性。同时,选用FAS的下游通路中Caspase 3特异性抑制剂(Z-DEVD-FMK)进一步验证其凋亡通路。不仅如此,我们还分选出健康人与TET2突变的MDSs患者骨髓中的造血干细胞,在体外向红系定向分化,检测TET2突变对细胞凋亡和FAS表达的影响。最后,由于TET2突变参与了多种血液肿瘤的发生,因此,我们在红白血病细胞系K562中敲低TET2的表达,检测TET2表达下降对K562细胞增殖及凋亡的影响。同时,在K562细胞中过表达FAS,检测其对增殖和凋亡的影响。研究结果:为了探究TET2在红系祖细胞发育过程中发挥的功能,我们首先验证了感染TET2-shRNA的CD34~+细胞的敲低效率,结果显示,实验组TET2的表达水平大约是对照组TET2的表达水平的40%。在有效敲低TET2的基础上,进一步分选出TET2-CFU-E,且在体外红系发育培养体系中继续培养,我们发现TET2有效敲低后,其分化受阻。为了探究分化受阻的细胞相关的表型,分选出功能异常的细胞(M-CFU-E),继续用红系培养体系培养,我们发现其凋亡显著增加。其次,为明确其相关凋亡分子,通过RNA-seq测序分析,结果显示Luciferase CFU-E和M-CFU-E之间有多达400个差异基因,含25个与凋亡相关信号通路相关的基因,其中16个表达上调,有FAS、NCKAP1和TNFRSF10B等,其表达显著上调。通过qRT-PCR和流式检测进一步验证FAS的表达,结果显示与Luciferase CFU-E相比,TET2-CFU-E细胞FAS表达不变,而M-CFU-E细胞中表达上调。为了探讨TET2敲低引起FAS上调的机制,我们检测将上述三组细胞进行FAS启动子区关键CCGG位点(-305,-251,-136,-90)5-mC和5-hmC检测,结果显示,与Luciferase CFU-E相比,TET2-CFU-E和M-CFU-E细胞中FAS关键CCGG位点的5-mC和5-hmC并没有发生改变,因此FAS的表达可能不直接受TET2调控,TET2和FAS之间还存在其他的靶基因来相互调控基因的表达。为了进一步探究TET2缺失是否通过调控FAS下游信号分子Caspase 3引起凋亡,因此,我们选用TET2敲低后分选出的M-CFU-E进行挽救实验,结果显示,与Luciferase CFU-E相比,Caspase 3特异性抑制剂(Z-DEVD-FMK)不能回复M-CFU-E细胞的凋亡,这表明TET2敲低后红系早期祖细胞产生的凋亡并不依赖于Caspase 3凋亡的通路。与此同时,我们发现与健康人相比,TET2突变的MDSs患者骨髓细胞的造血干细胞在红系发育分化的第11天和13天其凋亡显著增加,同时,FAS的表达在从11天到17天均上调。最后,由于高风险性向白血病转化是MDSs疾病的重要特征,而细胞凋亡在MDSs的发生和演变的过程中扮演重要角色。为了探讨TET2调控的细胞凋亡在MDSs的演变中的功能,我们首先比较健康人骨髓细胞与血液肿瘤细胞K562中的TET2和FAS的表达水平,结果显示,TET2在K562细胞中的表达为健康人骨髓细胞的一半,并且FAS在K562细胞中不表达。为进一步明确TET2在K562细胞中的功能,我们首先得到TET2敲低的K562细胞,随后利用Hemin诱导其向红系分化,结果显示,与对照组相比,TET2敲低促进细胞增殖,但不影响细胞凋亡,同时FAS的表达也没有改变。进一步在K562细胞中过表达FAS,结果显示,高水平的FAS能够促进K562细胞的凋亡从而抑制其增殖。这表明,FAS的表达水平可能是TET2突变的MDSs疾病是否发生演变的重要调控分子,FAS及其下游信号通路可能作为潜在的药物靶点治疗血液肿瘤。结论:综上所述,本论文探究了TET2在红系祖细胞阶段的重要功能:TET2敲低产生功能异常的M-CFU-E,其分化受阻、凋亡增加以及死亡受体FAS表达上调。TET2敲低不引起FAS启动子区关键位点甲基化和去甲基化的改变,因此,TET2可能间接调控FAS的表达。TET2敲低诱导的细胞凋亡不依赖Caspase 3通路。与此同时,TET2突变的MDSs患者的骨髓细胞也伴随大量凋亡,并且FAS的表达显著上调。不仅如此,TET2敲低还能促进血液肿瘤细胞系K562增殖,但不影响其凋亡。而过表达FAS却能促进K562细胞的大量凋亡。因此,FAS的表达水平可能作为TET2突变导致的MDSs疾病能否转变为白血病的重要标志。通过本论文的研究,为TET2突变的MDSs疾病相关的凋亡机制提供新的视角,也为治疗MDSs疾病提供新的科学依据。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R551.3
【部分图文】：

第一章 引言是 HPCs 中重要的一个分支，具有向巨核系和红系双向分化的特性[17]，存在促红细胞生成素（Erythropoietin，EPO）和干细胞因子（Stem cell factor，SCF）条件下，MEPs 能分化形成红系祖细胞阶段（BFU-E 至 CFU-E）[9]，继而进入终末红系分化阶段（Pro-E 至 Ortho-E），最终形成功能成熟红细胞。对正常的人机体来说，红细胞必不可少。由于红细胞特殊的结构，不但可以维持红细胞特殊的双面凹陷圆盘形状，使其能够最大限度地摄取 O2，而且也增加了红细胞膜的柔韧度和变形能力，这也为细胞的穿梭和更好的输送 O2提供便利及条件。此外，红细胞中特有一种血红蛋白，能和肺部与 O2结合形成氧合血红蛋白，这蛋白是红细胞载 O2的基础。此外，在整个发育的过程中，细胞表面的标记分子也发生了相应的变化，进一步来区分各个阶段的细胞，为后续分选出各阶段细胞提供依据（图 1.1）[18]。

图 1.2 TET 蛋白家族的结构图和 DNA 去甲基化的循环过程。（A）TET 蛋白家族的结构图及相关的结构域[43]；（B）DNA 去甲基化的循环过程。DNA 甲基转移酶（DNMTs）将未经修饰的 C 转化为 5-mC。5-mC 可以转换回尿嘧啶（U）。经 TET 介导氧化成 5-hmC、5-fC和 5-caC，然后切除 5-fC 或 5-caC 结合碱基切除修复（活性修饰-活性去除（AM-AR）的过程）或依赖复制稀释的 5-hmC、5-fC 或 5-caC（活性修饰的过程）[53]。1.2.2 红系发育中 TET2 研究进展TET2在造血干细胞中扮演着重要的角色，小鼠和人类的造血细胞中均表达，尤其小鼠的造血干/祖细胞（Hematopoietic stem/progenitors cells，HSPC）中高表达[55]，Tet2 缺失导致小鼠造血功能异常，具有较强的自我更新能力、造血再生能力增强和向髓系细胞优先分化的特点[56-58]。2011 年，徐明江等人建立了 Tet2敲除小鼠模型，发现骨髓细胞 5-hmC 水平显著降低和 5-mC 水平升高，并且增加了髓系恶性肿瘤发生前的 LSK（linnegSca1+cKit+）细胞池，其 LSK 细胞具有较强的造血再生能力，细胞分化也发生了改变。此外，大约 1/3 Tet2-/-和 8% Tet2+/-缺失 的 小鼠 在 2 至 4 月龄 时 ，出 现了 类似 慢 性髓 系白 血 病 （ Chronicmyelomonocytic leukemia，CMML）的表型，这是因为髓系恶性肿瘤比如髓系白

7图 1.3 MDSs 患者细胞的形态和 TET2 是 MDSs 疾病的高频突变基因。（A）MDSs 患者（图片来源于网络）；（B）MDSs 细胞形态（图片来源于网络）；（C）AML 细胞形态（图片来源于网络）；（D）MDSs 疾病高频突变基因[64]。1.2.4 MDSs 与凋亡MDSs 常伴凋亡增强[65]。早年研究表明，和正常人骨髓（NBM）相比，MDSs中 RA/RARS 和 RAEB 中细胞凋亡明显增加，P<0.0001（图 1.4A）[66]，和早期祖细胞的凋亡高于正常组（图 1.4B）[67]。另有报道，与 NBM 相比，MDSs 患者骨髓单个核细胞中 FAS 及其配体 FASL 均表达上调（图 1.4C）[68]。目前，MDSs疾病中产生的凋亡是否通过 FAS 下游的信号分子 Caspase 3 起作用，其详细机制还有待与进一步地探究。
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本文编号：2866577