目的:血清磷酸盐的正常水平为3.0-4.5mg/dL,其作为人体重要营养物质之一,参与到人体内多种调节和代谢过程。高磷血症,即血清中无机磷酸盐的水平增高,与心血管疾病发病率和死亡率的增加相关。有研究显示升高的磷酸盐会加重慢性肾脏病患者心血管疾病的发生和发展。即使对于健康人群来说,饮食中摄入含磷量过高的食物也会增加心血管疾病的发生率和死亡率。高磷酸盐会诱发血管平滑肌细胞向成骨样细胞转变,最终发展成血管钙化。虽然已有研究表示高磷酸盐会导致内皮细胞的凋亡,但对其中的机制的研究尚不多。某些数据显示microRNA会调控细胞的生长和凋亡情况,由microRNA的表达改变而引起的异常调节被认为是引起心血管不利结局的主要机制之一。本次研究主要针对高磷酸盐如何诱导内皮细胞凋亡进行研究,探讨microRNA在此过程中起到的作用,以及其他潜在机制。研究方法:1.实验分组本实验应用小鼠心肌内皮细胞进行研究。应用无磷酸盐(0mmol/L)以及含有0.1mmol/L、1.0mmol/L、5.0mmol/L浓度磷酸盐的DMEM培养液培养细胞,进行细胞生长以及基因微列阵实验。在探讨凋亡情况以及蛋白等表达变化实验中,主要应用两组含磷量不同的培养液进行细胞培养:对照组:含有磷酸盐浓度为1.0mM的正常培养液;实验组:含有磷酸盐浓度为5.0mM的高磷酸盐培养液。培养72小时后,检测细胞的凋亡情况、相关蛋白表达情况、RNA和microRNA的表达水平。针对microRNA-21如何参与此过程的研究中,需进行细胞转染后用不同培养液培养。共分为六组,即分别以对照组、实验组、miR-21模仿剂组、模仿剂对照组、miR-21抑制剂组、抑制剂对照组培养细胞后,检测细胞凋亡以及蛋白表达情况。在ERK1/2调节研究中,分别应用对照组、实验组、ERK1/2抑制剂组、抑制剂阴性对照组进行细胞培养72小时后,检测相关蛋白变化。2.xCELLigence分析细胞生长情况应用xCELLigence实时细胞电子分析技术进行细胞生长曲线测定。以含有不同磷酸盐浓度(0mM、0.1mM、1.0mM和5.0mM)的培养液培养细胞。应用分析仪每一个小时监测一次细胞生长情况,实验结束后生成细胞生长曲线。3.免疫荧光染色实验测定细胞凋亡情况将细胞用正常和高磷酸盐培养液培养72个小时之后,应用细胞死亡检测试剂盒进行染色后在免疫荧光显微镜下观察细胞凋亡情况。4.流式细胞术检测细胞凋亡情况以相应的条件培养细胞后,根据所应用的凋亡检测试剂盒说明书进行细胞标记染色。分别加入膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素标记液以及碘化丙啶标记液。孵育5分钟后用流式细胞仪进行细胞凋亡的分析。5.基因微列阵检测实验检测microRNA的表达应用不同磷酸盐含量(0mM,0.1mM,1.0mM和5.0mM)的培养液培养72小时,提取全部RNA后提交给美国北卡罗莱纳大学微列阵实验室部门进行杂化以及微列阵差异性显著分析。6.细胞转染实验检测凋亡以及PDCD4、NF-κB表达情况依照设计的分组应用RNAiMAX转染试剂盒进行microRNA21模仿剂和抑制剂转染实验后,应用不同浓度磷酸盐培养液培养72小时。用流式细胞术检测细胞凋亡情况,western blot方法检测PDCD4、NF-κB的表达水平。7.细胞高磷短暂激活实验检测ERK1/2的表达将内皮细胞用高磷酸盐培养液进行细胞培养,分别培养的时间为0分钟,1分钟,5分钟,10分钟,30分钟和60分钟。行western blot实验检测ERK1/2和p-ERK1/2的表达变化。8.Western Blot检测PDCD4、PTEN、PARP、NF-κB的表达以相应条件培养细胞后,行western blot实验。加样后,电泳30分钟,转膜1个小时,应用5%脱脂奶粉封闭一个小时。使用的一抗为兔抗cleaved caspase-3、兔抗PDCD4、兔抗PTEN、兔抗PARP、兔抗ERK1/2、兔抗p-ERK1/2、兔抗NF-κB(RelA p65)、兔抗NF-κB1、兔抗NF-κB2以及鼠抗β-actin,4℃过夜。孵育二抗完毕后,应用ECL曝光试剂进行曝光。用ImageJ软件分析条带密度值。9.RT-PCR实验检测microRNA的表达以及相关蛋白在RNA表达水平MicroRNA的RT-PCR实验是应用miRNeasy试剂盒提取RNA,miScript II RT试剂盒进行逆转录后应用miScript SYBR Green PCR试剂盒进行RT-PCR样品配制。PDCD4、PTEN、PARP、NF-κB的RT-PCR实验,首先应用RNeasy试剂盒提取RNA,iScript试剂盒进行逆转录后,应用SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix试剂盒进行RT-PCR样品配制。最后应用QuantStudio 6 Flex PCR仪器分别使用相应的RT-PCR步骤进行实验。完成后,用2~(-ΔΔCT)法进行计算。10.ERK抑制剂实验检测PDCD4以及NF-κB表达变化依照分组情况分别培养细胞72小时后应用western blot检测ERK1/2、p-ERK1/2、PDCD4以及NF-κB的表达。11.统计方法所有的数据都以均数±标准差(mean±SD)来进行表达,以T检验(t test)来进行统计学分析。p0.05时有统计学意义。应用SPSS 19.0软件进行统计学分析。实验结果:1.高磷酸盐导致内皮细胞凋亡(1)xCelligence系统实时监控细胞生长情况,结果显示:内皮细胞在含有0mM浓度磷酸盐的培养液中生长较为缓慢。在前48小时之内,0.1mM、1.0mM和5.0mM磷酸盐含量的培养液条件下细胞生长情况是相近的。第三天后,5mM磷酸盐含量培养液培养的内皮细胞数目出现了下降偏差。(2)免疫荧光染色实验和流式细胞实验显示,相比正常培养液组,在高磷酸盐培养液培养下的内皮细胞,凋亡数目有所增加(p0.05)。(3)Western blot检测Cleaved Caspase-3蛋白表达,相对于正常培养液组,高磷培养液培养组的凋亡相关蛋白Cleaved Caspase-3有明显的升高(p0.05)。2.高磷酸盐使microRNA-21的表达增加(1)应用Affymetrix基因微列阵检测实验检测547个microRNA的表达。与正常培养液培养组相比,在高磷酸盐的条件下,9个microRNA有明显的增加,65个microRNA的表达下降。在这74个microRNA当中,1.0mM和5.0mM同时与0mM和1.0mM对比,33个microRNA有明显的变化。microRNA-21在磷酸盐浓度为5.0mM时有明显的增加,microRNA-145,-143,-143hg,-22,-5123以及-1938在5.0mM的浓度中有所下降,microRNA-125和其他24个microRNA在0mM和5.0mM两种磷酸盐浓度中均有提升或者下降。(2)RT-PCR检测所选取的部分重点microRNA,与正常培养液组相比,microRNA-21、-125在高磷酸盐下表达有所增加(p0.05);microRNA-142、-143有所下降(p0.05)。3.MicroRNA21直接调节由高磷酸盐诱导的内皮细胞凋亡应用microRNA-21模仿剂和抑制剂转染后进行不同磷酸盐浓度的培养。与正常培养液组相比,加入模仿剂的正常培养液组和高磷酸盐培养液组凋亡数目有所增加(p0.05);与高磷酸盐培养液组相比,加入抑制剂的高磷酸盐培养液组凋亡数目有所减少(p0.05)。4.MicroRNA-21调节由高磷酸盐引起的PDCD4降低(1)Western blot检测microRNA-21的目标蛋白PDCD4、PTEN和PARP,相对于正常培养液组,在高磷酸盐培养液培养条件下表达都有所减少(p0.05)。(2)应用RT-PCR检测以上目标蛋白在RNA水平表达,与正常磷酸盐组相比,高磷酸盐组的表达有所下降(p0.05)。(3)应用microRNA-21模仿剂和抑制剂实验检测PDCD4的表达。与正常磷酸盐组相比,PDCD4在高磷酸盐组和模仿剂加正常磷酸盐组中都有所下降(p0.05);与高磷酸盐组相比,抑制剂加高磷酸盐组中的PDCD4有所上升(p0.05)。5.高磷酸盐激活ERK1/2通路调节PDCD4的表达(1)在高磷酸盐的短时间刺激下,ERK1/2发生磷酸化,即p-ERK1/2的表达在短时间内就有所增加。(2)长时间(72小时)高磷酸盐培养液培养细胞,与正常培养组相比,高磷酸盐组的p-ERK1/2表达有所增加(p0.05)。(3)应用ERK1/2抑制剂检测PDCD4表达的变化。与正常培养液组相比,高磷酸盐组的PDCD4表达下降(p0.05);应用ERK1/2抑制剂组的p-ERK1/2表达明显下降(p0.05),而此时该组的PDCD4表达有所增加(p0.05)。6.ERK1/2调控由高磷酸盐引起的NF-κB的降低(1)在不同磷酸盐含量(1.0mM和5.0mM)的培养液中培养细胞72小时之后,用western blot检测NF-κB各亚群(RelA,NF-κB1和NF-κB2)的表达。与正常培养液组相比,RelA(p65)和NF-κB1的表达在高磷酸盐条件下明显下降(p0.05),NF-κB2没有变化。(2)应用ERK1/2抑制剂实验检测NF-κB(RelA)的变化。与正常组相比,高磷酸盐组RelA的表达有所下降(p0.05);与高磷酸盐组相比,ERK1/2抑制剂组的RelA表达有所增加(p0.05)。(3)应用microRNA-21模仿剂和抑制剂转转染,用不同条件培养内皮细胞后行western blot,NF-κB(RelA)的表达并没有变化。结论:1.高磷酸盐会在体外诱导内皮细胞的凋亡增加。2.MicroRNA-21可以调节由高磷酸盐引起的细胞凋亡,并使相关目标蛋白PDCD4的表达有所减少。3.此过程同时激活了ERK1/2/PDCD4传导通路。4.高磷酸盐下调了NF-κB的表达,此过程依赖ERK1/2传导通路而非microRNA-21通路。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R54
【部分图文】：
17图 2. 免疫荧光技术观察内皮细胞凋亡情况A.TUNEL 染色，磷酸盐含量 1.0mM；B.TUNEL 染色，磷酸盐含量 5.0mM；C.DAPI，磷酸盐含量 1.0mM；D.DAPI，磷酸盐含量 5.0mM如图 3 所示，应用流式方法再次验证在不同磷酸盐浓度培养液下内皮细胞的凋亡情况。结果显示：相比于正常培养液，在 5.0mM 磷酸盐含量培养液培养下的内皮细胞，凋亡数目有所增加（p<0.05）。
中国医科大学博士学位论文而磷酸盐浓度降低时它的表达也随之下降了。 该结果可以说明在内皮细胞中，microRNA-21 的表达或许是由磷酸盐所调节的。同样的，microRNA-145，-143，-143hg，-22，-5123 以及-1938 都是在 5.0mM 的浓度中有所下降，而在磷酸盐浓度下降后反而有所提升。另一方面，结果显示 microRNA-125 和其他 24 个 microRNA 在 0mM和 5.0mM 两种磷酸盐浓度中均有提升或者下降。
中国医科大学博士学位论文而磷酸盐浓度降低时它的表达也随之下降了。 该结果可以说明在内皮细胞中，microRNA-21 的表达或许是由磷酸盐所调节的。同样的，microRNA-145，-143，-143hg，-22，-5123 以及-1938 都是在 5.0mM 的浓度中有所下降，而在磷酸盐浓度下降后反而有所提升。另一方面，结果显示 microRNA-125 和其他 24 个 microRNA 在 0mM和 5.0mM 两种磷酸盐浓度中均有提升或者下降。
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本文编号：
2866742
