第一部分Micro-CT主动脉增强造影在主动脉夹层模型小鼠活体观察中的应用研究背景主动脉夹层小鼠模型是目前较常用的主动脉夹层动物模型,由于缺乏相应的影像技术,目前判断主动脉病变情况的方法主要依靠主动脉病理学检测结果,该过程须处死造模动物,因此无法动态观测夹层形成过程和病情进展情况,给研究造成了一定的局限性,因此亟需一种可以活体观察主动脉病变情况的成像方法。研究目的本研究拟通过联合应用micro-CT和对比剂获得针对小鼠主动脉夹层的最佳成像方案,实现对夹层模型小鼠主动脉病变区的活体观察,以应用于以主动脉夹层为代表的主动脉扩张性疾病的基础研究。探讨对比剂种类、扫描时间、对比剂剂量对小鼠主动脉增强造影成像效果的影响,初步总结小鼠主动脉增强造影的最佳方案;建立主动脉夹层小鼠模型,验证扫描方案的可行性和有效性。研究方法选取ExiTron nano 12000和eXIA 160XL两种常用小动物对比剂,将6只C57BL/6野生型正常小鼠随机分为2组,Ⅰ组(ExiTron nano 12000组)、Ⅱ组(eXIA160XL组),通过鼠尾静脉将两种小动物对比剂分别注射到小鼠体内,通过micro-CT扫描观察两种对比剂的造影效果并选出主动脉成像效果最佳的对比剂;将3只C57BL/6野生型正常小鼠在注射基于上述实验得出的最佳对比剂后即刻、1h、2h、3h、6h和12h进行micro-CT扫描,通过观察扫描图像得出最佳的扫描时间;应用上述实验得出的最佳对比剂和最佳扫描时间,将21只主动脉夹层小鼠随机分为3组,3组分别注射不同剂量的对比剂,Ⅰ组(70μl/25g组)、Ⅱ组(100μl/25g组)、Ⅲ组(150μl/25g组),通过比较得出主动脉成像效果最佳的对比剂剂量。解剖小鼠,采集主动脉标本,通过苏木素-伊红(HE)染色,借助NDP.view 2软件测量小鼠主动脉直径,并与micro-CT测量所得的直径进行比较,验证扫描方案的可行性和有效性。结果主动脉增强造影结果显示,ExiTron nano 12000对比剂CT峰值为610HU,在体内停留时间约12小时;eXIA 160XL对比剂CT峰值为235HU,在体内停留时间约6小时。ExiTron nano 12000对比剂成像效果优于eXIA 160XL对比剂。在ExiTron nano 12000对比剂注射后即刻、1h、2h、3h、6h和12h进行Micro-CT扫描,结果显示小鼠在注射对比剂后2h,主动脉CT值达到最高,主动脉的成像效果最佳;通过比较注射不同剂量ExiTron nano 12000对比剂的夹层小鼠主动脉成像效果,结果显示对比剂剂量达到100μl/25g时,可清晰显示主动脉结构,观察到主动脉夹层真假腔;将micro-CT扫描得到的主动脉直径值与样本组织HE染色得到的主动脉直径值进行比较,两者基本一致(R~2=0.96)。结论Micro-CT和ExiTron nano 12000对比剂的联合应用可活体动态观察小鼠主动脉形态;对比剂ExiTron nano 12000注射后2小时为最佳的扫描时间;最佳对比剂剂量为100μl/25g。该扫描方案可用于小鼠主动脉的增强造影成像,也可用于夹层小鼠主动脉的活体动态观察,适用于主动脉疾病的基础实验研究。第二部分N-乙酰基-L-半胱氨酸在主动脉夹层血管重构中的作用及机制研究研究背景主动脉夹层(Aortic dissection,AD)是一类十分凶险的致死性主动脉疾病,随着我国人口结构的逐渐老龄化,以主动脉夹层为代表的主动脉扩张病发病率逐年上升。我们前期研究发现,主动脉夹层患者血清中L-半胱氨酸水平明显低于健康志愿者,且在构建小鼠主动脉夹层模型过程中添加L-半胱氨酸饮食可明显减低夹层发生率,说明L-半胱氨酸可影响主动脉夹层的发生。N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)为L-半胱氨酸的水溶性前体,在体内可直接转化为L-半胱氨酸,已有研究表明NAC可调节细胞代谢活性、减轻DNA损伤,具有一定的抗氧化和抗炎作用。因此本研究拟观察NAC能否影响造模成功后夹层小鼠模型主动脉血管重构,从而影响主动脉夹层的转归,为主动脉夹层的干预策略提供新靶点和新思路。研究目的主动脉夹层小鼠模型构建成功后,在小鼠饮食中添加NAC,干预主动脉夹层小鼠体内L-半胱氨酸含量,观察NAC是否可以逆转主动脉病变的扩张程度或严重程度,最终能否参与主动脉血管重构从而影响夹层转归。研究方法随机选取3周龄C57BL/6野生型小鼠,采用饮水中添加β-氨基丙腈(1g/kg/d)喂养4周,然后在小鼠背部皮下植入血管紧张素Ⅱ微泵(1μg/kg/min)3天的方法,建立小鼠主动脉夹层模型。同时,使用3周龄C57BL/6野生型小鼠,正常饮水,4周后,麻醉下小鼠背部皮下植入生理盐水微泵3天(假手术组)。将49只主动脉夹层模型小鼠随机分为2组,分别用NAC(主动脉夹层模型+NAC组,Model+NAC Group)和生理盐水(主动脉夹层模型+生理盐水组,Model Control Group)进行干预。研究过程中如果小鼠发生死亡,立即记录小鼠死亡时间,干预28天后,根据记录结果绘制生存曲线;主动脉夹层模型小鼠干预28天后,利用小动物超声检测小鼠射血分数(EF)和缩短分数(FS),排除NAC对小鼠的心功能;分别在NAC干预后的第1天、第14天、第28天,使用micro-CT动态观察干预过程中小鼠主动脉病变情况的变化;干预28天后,处死小鼠,解剖分离小鼠主动脉,取主动脉根部至髂总动脉段进行HE染色,参考主动脉病变严重程度的评估标准,对每个组织样本主动脉病变的严重程度进行评估;测量主动脉各段(升主动脉、主动脉弓、胸降主动脉、肾上主动脉)管腔直径;Masson染色分析胶原纤维的降解程度,并计算小鼠主动脉胶原容积分数;EVG染色分析弹性纤维的降解程度;免疫组织化学方法检测主动脉中、外膜中性粒细胞特异性标记物Ly6G+的表达情况,定量分析各组小鼠主动脉中性粒细胞含量差异。结果生存曲线结果显示Model+NAC Group(23/25,92%)和Model Control Group(18/24,75%)两组间小鼠生存率差异无统计学意义(P=0.09);小动物超声结果显示Model+NAC Group和Model Control Group两组小鼠射血分数(EF)和缩短分数(FS)差异无统计学意义(EF,P=0.43;FS,P=0.07);应用micro-CT动态观察夹层小鼠主动脉的变化过程,我们发现Model+NAC Group和Model Control Group小鼠升主动脉变化差值(-0.087±0.064mm VS 0.075±0.055mm,P0.001)、主动脉弓变化差值(-0.084±0.066mm VS 0.066±0.055mm,P0.001)相比,差异有统计学意义。而胸降主动脉直径变化差值(0.012±0.036mm VS 0.02±0.03mm,P=0.428)和肾上主动脉直径变化差值(-0.007±0.036mm VS 0.01±0.021mm,P=0.055)两组之间差异无统计学意义;Model+NAC Group(36%)小鼠严重主动脉夹层(夹层和破裂)的发生率较Model Control Group(66.67%)显著降低,两组间差异有统计学意义(P=0.03);HE染色结果显示Model+NAC Group小鼠升主动脉直径(1.52±0.35mm VS 1.77±0.43mm,P=0.027)和主动脉弓直径(1.34±0.18mm VS 1.47±0.26mm,P=0.039)明显小于Model Control Group,而Model+NAC Group和Model Control Group小鼠胸降主动脉直径(1.16±0.12mm VS 1.20±0.29mm,P=0.54)和肾上主动脉直径(0.97±0.08mm VS0.99±0.08mm,P=0.45)之间差异无统计学意义;Model Control Group(3.00±0.78)和Model+NAC Group(2.64±0.86)小鼠主动脉胶原纤维的降解程度差异无统计学意义(P=0.09);Model Control Group(43.83±6.39%)和Model+NAC Group(54.37±6.59%)小鼠主动脉胶原容积分数明显高于Sham Operation Group(20.60±3.08%),通过组间对比,Model+NAC Group(54.37±6.59%)小鼠主动脉胶原容积分数明显高于Model Control Group(43.83±6.39%),两组之间差异有统计学意义(P0.01);Model+NAC Group(2.96±0.81)和Model Control Group(2.76±0.88)小鼠主动脉弹性纤维的降解程度差异无统计学意义(P=0.37);Model+NAC Group(7.72±3.95%)小鼠主动脉中性粒细胞含量明显低于Model Control Group(10.04±4.43%),两组间差异有统计学意义(P=0.037)。结论NAC可减轻夹层主动脉的扩张程度和严重程度,降低严重主动脉夹层(夹层和破裂)发生率;NAC可促进胶原在主动脉中膜的沉积,降低中性粒细胞在主动脉病变部位的浸润和聚集,促进夹层模型小鼠主动脉正向重构,在一定范围内影响夹层转归。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R543.1
【部分图文】：
军军医大学硕士学位论文前 言主动脉夹层（Aortic dissection, AD）指主动脉内膜处出现撕裂口，血液从主动膜撕裂处进入主动脉中膜，使内膜、中膜分离，沿主动脉长轴形成主动脉壁的真腔[1-3]。随着病情进展，血液可冲破主动脉壁，危及患者生命，甚至导致患者突亡，是一类十分凶险的致死性主动脉疾病[4, 5]。根据 AD 起始撕裂口出现的位置和撕裂的累及范围，AD 在临床上主要有两种方法，分别是 Stanford 分型和 De Bakey 分型（见图 1-1）。
（4）在生物安全柜无菌条件下，拔下微泵针芯，用 27G 平针头和 1 ml 注射器，按照微泵操作指南将 Ang II 溶液注入微泵，动作轻柔，使微泵内充满 Ang II 溶液而没有气泡残留；（5）将配好的微泵放入含生理盐水的 15 ml 离心管中，37℃恒温箱中过夜。3、血管紧张素 II/生理盐水皮下微泵植入（1）戊巴比妥钠溶于生理盐水并混匀配制浓度为 1%的麻醉药；（2）按 0.1 ml/10g 的剂量给予小鼠腹腔注射麻醉；（3）待小鼠角膜反射消失、四肢瘫软无力后将小鼠固定于手术台上，剃去颈后毛发并以碘伏消毒；（4）于小鼠颈后皮肤消毒区剪开约 1 cm 横行切口，扩大皮下腔隙；（5）将 Ang II 微泵植入小鼠颈背部皮下腔隙内，微泵开口朝向小鼠尾部；（6）使用带针缝合线缝合切口；（7）待小鼠苏醒后放回笼内继续饲养。
图 1-3. Micro-CT 活体扫描：Skyscan1076 Micro-CT（A）；固定小鼠并将小鼠置于 CT 机载物台上（B）Fig 1-3. Micro-CT living scanning: Skyscan1076 Micro-CT (A); An anesthetizedmouse was fixed and set on the object stage of the micro-CT apparatus (B)3、小鼠对比剂选 取 两 种 常 用 小 动 物 对 比 剂 ExiTron nano 12000 （ Miltenyi Biotec,Bergisch-Gladbach, Germany）和 eXIA 160XL（Binitio Biomedical, Canada），将 6 只小鼠随机分为两组，Ⅰ 组（ExiTron nano 12000 组）和Ⅱ 组（eXIA 160XL 组），将两种对比剂分别通过尾静脉注射到小鼠体内，观察并选择主动脉增强成像效果最佳的对比剂并用于后续实验。在我们实验中用于小鼠主动脉成像的对比剂是 ExiTron nano 12000 和 eXIA160XL。ExiTron nano 是一种碱土金属纳米对比剂，专门用于临床前的动物实验研究。对比剂纳米颗粒被聚合物涂层包裹，其平均流体动力学直径为 110 nm，ExiTron nano12000 未经稀释对比剂的 CT 值约为 12000 HU。eXIA 160XL 对比剂是一种含高碘的
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本文编号：
2870196
