蛋白激酶A（PKA）在血小板凋亡中的作用

发布时间：2020-11-04 23:26

　　 【目的】探究蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)在血小板凋亡中所发挥的作用。【方法】采集健康志愿者空腹静脉全血,分离得到洗涤血小板及富含血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP),调整血小板的浓度至3×108/ml。人的洗涤血小板与不同浓度的PKA抑制剂H89或对照二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)于22℃孵育160min,利用Western blot检测血小板PKA底物GPIbβ(Ser166)的磷酸化程度,用电子显微镜观察血小板的形态改变。人的洗涤血小板与H89(37.5μM)或对照DMSO于22℃孵育不同的时间,使用流式细胞仪检测血小板线粒体跨膜电位(Mitochondrial inner transmembrane potential,ΔΨm)变化和磷脂酰丝氨酸(Phosphatidylserine,PS)外翻程度。洗涤血小板与不同浓度的PKA激活剂Forskolin或阴性对照(DMSO)在室温下孵育10min,然后用ABT737(1μM)在37℃条件下处理90min,利用流式细胞仪检测血小板ΔΨm和PS外翻的变化。采集6-8周三种PKA(PKA~(+/+)、PKA~(+/-)、PKA~(-/-))基因型小鼠下腔静脉全血,分别检测血小板的数量,PKA蛋白的表达情况和PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,并且检测血小板ΔΨm去极化程度。给野生型ICR小鼠注射PKA的抑制剂Rp-c AMPS,之后使用血细胞计数仪检测小鼠体内血小板数量。从糖尿病患者和正常人全血中分别分离血小板和富含血小板血浆(Platelet rich plasma,PRP),使用Western blot检测血小板中PKA底物GPIbβ的磷酸化程度,用ELISA法检测血小板中PKA的活性,并利用流式细胞仪检测血小板ΔΨm和PS外翻的变化。利用ELISA法检测糖尿病患者和正常人血浆中凝血酶产生的情况。在体外分别用Forskolin和不同浓度的凝血酶处理血小板,利用流式细胞仪检测血小板ΔΨm和PS外翻的变化。【结果】H89能够导致血小板中PKA底物GPIbβ去磷酸化,ΔΨm去极化,PS外翻,质膜皱缩。Forskolin能够抑制由ABT737诱导的血小板ΔΨm去极化,PS外翻。与PKA~(+/+)小鼠相比,PKA~(-/-)小鼠体内血小板数量明显减少,PKA蛋白表达量明显减少,PKA底物GPIbβ的磷酸化程度降低,血小板ΔΨm去极化。此外,PKA的抑制剂Rp-c AMPS能够导致野生型ICR小鼠体内血小板数量减少。与正常对照组相比,糖尿病患者组血小板的PKA底物GPIbβ的磷酸化程度降低,ΔΨm去极化和PS外翻。糖尿病患者组血浆中凝血酶的含量明显高于正常对照组。体外实验中,凝血酶能够诱导血小板凋亡,并且Forskolin能够抑制由凝血酶诱导的血小板凋亡。【结论】这些数据表明:PKA能够调控线粒体介导的血小板凋亡,PKA与某些疾病中血小板数量的减少相关。这些发现为血小板减少症患者的诊断和治疗提供了新的思路。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R55
【部分图文】：

图 1. H89 剂量依赖性诱导血小板 GPIbβ 蛋白去磷酸化利用 Western blot 检测血小板中 GPIbβ、p-GPIbβ 的表达情况。ern blot 上样量一致的标准。H89 时间依赖性诱导血小板 ΔΨm 去极化

图 1. H89 剂量依赖性诱导血小板 GPIbβ 蛋白去磷酸化利用 Western blot 检测血小板中 GPIbβ、p-GPIbβ 的表达情况。ern blot 上样量一致的标准。H89 时间依赖性诱导血小板 ΔΨm 去极化

图 2. H89 时间依赖性诱导血小板 ΔΨm 去极化.利用流式细胞仪检测血小板 ΔΨm 变化。（Mean ±SD）。＊＊P＜0.01 DMSO 组相比。H89 时间依赖性诱导血小板 PS 外翻
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本文编号：2870764