转化生长因子-β1诱导人主动脉平滑肌细胞特异性改变及胶原纤维合成增加的机制研究

发布时间：2020-11-06 09:24

　　 第一部分:实验一:目的:下调人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMCs)的Rho激酶Ⅰ/Ⅱ(ROCKⅠ/Ⅱ)基因表达。方法:首先利用siRNA技术分别下调HA-VSMCs的ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ基因,24h后倒置显微镜下观察转染效果,细胞转染48h后将细胞分成6组:空白对照组、ROCKⅠsiRNA 组、ROCKⅡsiRNA 组、TGF-β1 组、ROCKⅠsiRNA+TGF-β1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β1 组,空白对照组、ROCK ⅠsiRNA 组、ROCK ⅡsiRNA 组在完全培养基中培养,TGF-β 1 组、ROCK siRNA+TGF-β 1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1组在含有5ng/mlTGF-β 1的完全培养基中培养,24h后Western blot检测各组ROCK Ⅰ、ROCK Ⅱ蛋白表达水平。结果:与空白对照组相比,TGF-β1组的ROCK Ⅰ蛋白表达明显升高(P0.05),而ROCK Ⅱ蛋白表达无明显变化(P0.05);与空白对照组相比,ROCK ⅠsiRNA组、ROCK ⅡsiRNA组HA-VSMCs中相应的靶蛋白ROCK Ⅰ、ROCKⅡ表达明显降低(均 P0.0 5);与 TGF-β 1 组相比,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1组HA-VSMCs中相应的靶蛋白ROCK Ⅰ、ROCKⅡ表达明显降低(均P0.05)。结论:成功构建HA-VSMCs的ROCK ⅠsiRNA和ROCK ⅡsiRNA转染模型。TGF-β 1可诱导HA-VSMCs的ROCK Ⅰ蛋白表达,ROCK ⅠsiRNA转染后可抑制此过程。实验二:目的:探讨ROCK Ⅰ/Ⅱ对TGF-β 1诱导的HA-VSMCs表型转化的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs分成5组:空白对照组、TGF-β1组、ROCKⅠ siRNA +TGF-β 1 组、ROCKⅡ siRNA+TGF-β 1 组、Y-27632+TGF-β 1 组(Y-27632为ROCK Ⅰ的特异性抑制剂);分别进行不同预处理,24h后Western blot及荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测各组细胞收缩型标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)、合成型标志蛋白骨桥蛋白(OPN)的蛋白表达量和mRNA含量。结果:与 TGF-β 1 组相比,ROCK Ⅰ siRNA+TGF-β 1 组 α-SMA、SM22 α 的蛋白表达量和mRNA含量均显著增加(P0.05),而OPN的蛋白表达量和mRNA含量均显著减少(P0.05);与TGF-β1组相比,ROCKⅡ siRNA+TGF-β 1组上述蛋白表达量和mRNA含量均无显著差异(P0.05)。结论:TGF-β1可诱导HA-VSMCs由收缩型向合成型表型转化,ROCKⅠ基因在这一转化中起重要作用,而ROCKⅡ基因的作用不明显。实验三:目的:探讨ROCK Ⅰ/Ⅱ对TGF-β 1诱导的HA-VSMCs迁移及增殖的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs分成5组:空白对照组、TGF-β 1组、ROCKⅠ siRNA+TGF-β 1 组、ROCKⅡsiRNA+TGF-β 1 组、Y-27632+TGF-β 1 组,分别进行不同干预处理后,利用Transwell、CCK-8试验检测各组细胞迁移、增殖能力。结果:与空白对照组相比,TGF-β1组细胞迁移数明显增加(P0.05);与TGF-β 1 组相比,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、Y-27632+TGF-β 1 组细胞迁移数减少[(6 1.0 ± 1.8)vs.(208.3±18.9);(63.3 ± 7.4)vs.(208.3 ± 18.9),均P0.05],而ROCK ⅡsiRNA+ TGF-β 1组细胞迁移无明显变化(P0.05)。与空白对照组相比,TGF-β1 组OD 值升高[(1.350±0.057)vs.(1.252±0.061),P0.05];与 TGF-β1 组比较,ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、ROCK ⅡsiRNA+TGF-β 1组、Y-27632+TGF-β 1组OD值均无明显变化(均P0.05)。结论:在TGF-β 1诱导的HA-VSMCs迁移中ROCK Ⅰ起重要作用,而在TGF-β 1诱导的HA-VSMCs增殖中ROCK Ⅰ和ROCK Ⅱ的作用均不明显。第二部分:实验一:目的:探究HA-VSMCs和人主动脉内皮细胞(HA-ECs)共培养对合成胶原蛋白Ⅰ型(COL Ⅰ)和胶原蛋白Ⅲ型(COL Ⅲ)的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs和HA-ECs利用Transwell小室建立VSMC-EC共培养模型,VSMC上室,EC下室,24h后将细胞分为:EC对照组、VSMC对照组、VSMC-EC 共培养组、EC+TGF-β 1 组、VSMC+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+TGF-β1组,培养6h、12h、24h以及48 h后利用ELISA检测培养上清中COL Ⅰ和COL Ⅲ的含量。结果:与EC对照组、VSMC对照组相比,VSMC-EC共培养下COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著升高(P0.01),与EC+TGF-β 1组、VSMC+TGF-β 1组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著升高(P0.01),与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著升高(P0.01)。结论:VSMC-EC共培养可显著增加COL Ⅰ和COL Ⅲ的蛋白合成,而TGF-β 1对此过程有显著促进作用。实验二:目的:探究TGF-β 1诱导下人主动脉VSMC-EC共培养对ROCKⅠ和RhoA蛋白合成的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs和HA-ECs分为:VSMC、VSMC+TGF-β 1组、VSMC-EC 共培养组、VSMC-EC 共培养+TGF-β 1 组,24h 后利用 Western blot 检测ROCK Ⅰ和RhoA的蛋白表达量。结果:与VSMC对照组相比,VSMC-EC共培养组ROCKⅠ和RhoA蛋白表达量无明显差异(P0.05);与 VSMC+TGF-β 1 组相比,VSMC-EC 共培养+TGF-β 1 组 ROCKⅠ和RhoA蛋白表达量无明显差异(P0.05);与VSMC组相比,VSMC+TGF-β1组ROCKⅠ蛋白表达量明显增加(P0.05),而RhoA蛋白表达量无明显差异(P0.05);与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组ROCKⅠ蛋白表达量显著增加(P0.0 1),且RhoA蛋白表达量明显增加(P0.05)。结论:在TGF-β 1作用下有迁移能力的HA-VSMCs与HA-ECs共同培养可促进ROCK Ⅰ和RhoA的蛋白表达。实验三:目的:探究下调HA-VSMCs的ROCK Ⅰ基因表达后与HA-ECs共培养对合成C01Ⅰ、COlⅢ、ROCKⅠ 和 RhoA 蛋白的影响。方法:将体外培养的HA-VSMCs通过siRNA转染下调其ROCK Ⅰ基因,再将转染后的HA-VSMCs和未转染的HA-ECs分成5组:VSMC-EC共培养组、VSMC-EC共培养+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+ROCKⅠsiRNA+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+siRNA-C+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+Y-27632+TGF-β 1 组,24h 后 ELISA 检测不同分组COL Ⅰ和COLⅢ的含量,Western blot检测不同分组ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达量。结果:与VSMC-EC共培养+TGF-β 1组相比,VSMC-EC共培养+ROCKⅠsiRNA+TGF-β 1 组及 VSMC-EC 共培养+Y-27632 +TGF-β 1 组 COL Ⅰ 和 COLⅢ蛋白表达量显著减少(P0.01);与VSMC-EC共培养+TGF-β 1组相比,VSMC-EC共培养+siRNA-C+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量无明显差异(P0.05),与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白表达量显著增加(P0.01)。与VSMC-EC共培养+TGF-β1组相比,VSMC-EC共培养+ROCK ⅠsiRNA+TGF-β 1 组、VSMC-EC 共培养+Y-27632+TGF-β 1 组 ROCK Ⅰ 和RhoA蛋白表达量无明显差异(P0.05);与VSMC-EC共培养+TGF-β1组相比,VSMC-EC共培养+siRNA-C+TGF-β 1组ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达量无明显差异(P0.05);与VSMC-EC共培养组相比,VSMC-EC共培养+TGF-β 1组ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达量显著增加(P0.01)。结论:下调HA-VSMCs的ROCK Ⅰ基因可抑制TGF-β 1诱导的VSMC-EC共培养下COL Ⅰ和COL Ⅲ蛋白合成,而对TGF-β 1诱导的VSMC-EC共培养下ROCK Ⅰ和RhoA蛋白表达含量无影响。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R543.1
【部分图文】：

（所得数据均用Ｉ士ＳＤ表示，＊Ｐ＜０．０５ｖｓ．空白对照组；＃Ｐ＜Ｏ．Ｏ５ｖｓ．ＴＧＦ－０１组）??图１－２?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测ＲＯＣＫ?Ｉ蛋白的表达（柱状图与条带图分组对应）??ｉｇｕｒｅｌ?－２?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ＲＯＣＫ?Ｉ?ｐｒｏｔｅｉｎ?ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ?（Ｇｒｏｕｐｓ?ｉｎ?ｔｈｅ??ｉｓｔｏｇｒａｍ?ａｎｄ?ｓｔｒｉｐｅ?ａｒｅ?ｔｈｅ?ｓａｍｅ）??（３）?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ检测ＲＯＣＫ?ＩＩ蛋白的表达??如图卜３?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ结果所示，与空白对照组比较，ＲＯＣＫ?ＩｓｉＲＮＡ组??ＯＣＫ?ＩＩ蛋白表达减少（Ｐ?＜０．０５），而ＴＧＦ－Ｐ１组ＲＯＣＫ?ＩＩ蛋白表达无明显变??（Ｐ＞?０．?０５）；与?ＴＧＦ－Ｐ１?组比较，ＲＯＣＫ?ＩｓｉＲＮＡ＋ＴＧＦ－Ｐｌ?组?ＲＯＣＫ?ＩＩ?蛋白表??无明显变化（Ｐ＞〇．〇５）?，?ＲＯＣＫ?ＩＩｓｉＲＮＡ＋?ＴＧＦ－Ｐ１组ＲＯＣＫ?ＩＩ蛋白表达减少??（Ｐ〈０．?０５）。??

（所得数据均用ｘ土ＳＤ表示，＊Ｐ＜０．?０５?ｖｓ．空白对照组；＃Ｐ〈０．?０５?ｖｓ．ＴＧＦ?｜３ｌ组）??图３－１细胞迁移实验Ａ：结晶紫染色法观察（Ｘ１００）?；?Ｂ：各组迁移细胞数比较??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｃｅｌｌ?ｍｉｇｒａｔｉｏｎ?ａｓｓａｙ?Ａ：?Ｃｒｙｓｔａｌ?ｖｉｏｌｅｔ?ｓｔａｉｎｉｎｇ?ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ?（ｘｌＯＯ）；?Ｂ：??Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｔｈｅ?ｎｕｍｂｅｒｓ?ｏｆ?ｍｉｇｒａｔｉｎｇ?ｃｅｌｌｓ?ａｍｏｎｇ?ｇｒｏｕｐｓ??２５??

鞫?銎交?∠赴?ㄒ啤⒃鲋骋约氨硇妥??械淖饔茫崳?（２）?ＲＯＣＫ?Ｉ和ＲＯＣＫ?ＩＩ对ＴＧＦ－Ｍ诱导的ＨＡ－ＶＳＭＣｓ增殖的影响??如图３－２结果所示，与空白对照组相比，ＴＧＦ－Ｐ１组０Ｄ值升高［（１．３５０土??０．?０５７）?ｖｓ．?（１．?２５２±０＿?０６１），Ｐ＜０．?０５］；与?ＴＧＦ－?Ｐ?１?组比较，ＲＯＣＫ?ＩｓｉＲＮＡ＋ＴＧＦ－??０?１?组、ＲＯＣＫ?ＩＩｓｉＲＮＡ＋?ＴＧＦ－?Ｐ?１?组、Ｙ－２７６３２＋ＴＧＦ－０?１?组?０Ｄ?值均无统计学差异??（均?Ｐ＞０．０５）。??１．６００??１．４００??，１１１１１??＃??，／，??（所得数据均用５土ＳＤ表示，＊Ｐ＜０．０５?ｖｓ．空白对照组）??图３－２各组对ＨＡ－ＶＳＭＣｓ增殖情况比较??Ｆｉｇｕｒｅ３－２?Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ?ｏｆ?ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｓ?ｏｆ?ａｍｏｎｇ?ｅａｃｈ?ｇｒｏｕｐ?ｏｆ?ＨＡ－ＶＳＭＣｓ??讨论??近年来，随着生活水平的提高，ＴＡＤ的发生率呈逐年增加的趋势。目前，??有关ＴＡＤ的回顾性研究分析证实，胸主动脉腔内修复术（ｔｈｏｒａｃｉｃ?ｅｎｄｏｖａｓｃｕｌａｒ??ａｏｒｔｉｃ?ｒｅｐａｉｒ，ＴＥＶＡＲ）是治疗ＴＡＤ的首选治疗方案［４乂?ＴＡＤ常表现为突然地??剧烈撕裂样或剥脱样疼痛
【参考文献】

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本文编号：2872960