乳小鼠再生心肌磷酸化蛋白组学分析揭示CHK1激酶通过mTORC1促进梗死后心肌再生的重要作用

发布时间：2020-11-07 18:30

　　 目的:在哺乳动物中,心肌梗死后的再生治疗受到成年心脏有限的再生能力的限制,而新生心脏却维持着短暂的再生能力。对缺血损伤的新生心肌进行系统的磷酸化信号分析有助于挖掘激活或参与促进心脏再生程序的关键通路。因此,本研究的目的是解析新生心肌缺血损伤刺激再生的心肌组织内激酶-底物网络,并确定调控该再生程序的关键激酶和信号通路。方法:新生乳小鼠进行LAD结扎诱导心肌梗死后第6天,对梗死边缘区心肌进行定量磷酸化蛋白组学和定量蛋白组学分析;采用IGPS算法对磷酸化蛋白组学数据进行分析,获得激酶-底物调控网络和包括CHK1激酶在内的58个激酶。以ICR-CD1新生乳小鼠和成年小鼠为实验对象,在体内体外水平验证CHK1激酶对心肌再生的作用和相关机制。结果:在体内和体外水平,心肌细胞内特异性过表达CHK1激酶能够促进新生心肌细胞的增殖,延长新生心肌增殖时间窗;心肌细胞内特异性敲低CHK1削弱了新生心肌细胞的增殖以及损伤刺激后心肌再生修复能力。在成年小鼠心肌梗死后,梗死边缘区心肌特异性过表达CHK1,上调了m TORC1/P70S6K通路,促进下游靶基因的翻译水平,最终促进了成年心肌细胞的增殖并改善了梗死后的心功能。结论:新生乳小鼠心梗刺激后再生心肌组织的定量磷酸化蛋白组学分析帮助解析了新生心肌内源性再生过程中的重要信号通路网络。其中,CHK1激酶被发现是促进新生心肌再生过程的关键激酶。进一步,成年小鼠心肌过表达CHK1可通过激活m TORC1/P70S6K通路促进成年心脏心梗损伤后的再生修复。可见,CHK1激酶有望成为人类心肌梗死后再生治疗的潜在新靶点。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

图 1、新生乳小鼠接受 LAD 结扎诱导心梗手术造模成功（a）P1 小鼠 LAD 结扎诱导心肌梗死手术术后 4dpi，心肌连续切片 TTC 染色显示 MI 组和 Sham 心肌的梗死区域（白色）和非梗死区(红色)；（b）术后 1 个月内 MI 组和 Sham 组小鼠的生存率（Sham 组 n=7，MI 组 n=8）；（c）术后 1个月内 MI 组和 Sham 组小鼠的体重变化情况（Sham 组 n=7，MI 组 n=8）。数据采用 Mean±SEM 表示。2 新生小鼠心梗损伤后完全再生修复为了验证新生心脏梗死损伤后是否能进行完全再生修复，我们采用超高分辨率小动物超声影像系统对接受 LAD 结扎手术的新生鼠术后进行心功能检测，术后第 4 天时 MI 组小鼠心功能指标 EF 和 FS 值均明显下降，提示手术诱导心

南京医科大学博士学位论文天和术后第 27 天的 MI 组小鼠心脏进行组织间断切片，而后进行形态学染色，结果显示：术后第 4 天，HE 染色提示 LAD 血管支配区域的心肌部分出现组织坏死、炎性浸润，CTNT 免疫荧光染色提示 HE 染色指示的坏死区域心肌肌钙蛋白大量丢失；术后第 27 天，Masson 染色提示心肌未见明显纤维疤痕组织（除线头结扎处少量纤维疤痕外），CTNT 免疫荧光染色提示心肌组织未见明显肌钙蛋白丢失。见图 2d。上述结果提示新生乳小鼠心梗损伤后的 1 个月内实现功能和组织水平的完全再生恢复。

pH3 染色结果相符。见图 3 c-d。而 Sham 组小鼠的心肌细胞增殖率（PH3 和 Ki67染色）随天龄的增加呈现迅速而持续下降的趋势。此外，术后所观察的各时间点的pH3阳性非心肌细胞比例在MI组与Sham组组间未见明显差异。见图3 e。
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