能量代谢在心肌微循环再灌注损伤和心衰病理进展中的机制研究

发布时间：2020-11-08 21:52

　　 背景:再灌注治疗是目前治疗急性心肌梗死的主要方法,但是再灌注损伤却限制了患者的临床获益,增加了患者心衰的发生率。从再灌注损伤到进展为心衰的不同阶段,各种细胞(包括微循环内皮细胞和心肌细胞)发挥着不同的作用。我们的前期研究证实,再灌注损伤引起的微循环破坏是再灌注损伤发生的首要环节,并且微循环的破坏会进一步加重心肌细胞的缺氧损伤,最终引起心肌细胞发生坏死、纤维化,导致心衰的发生。因此,为了改善患者预后,减少患者心衰的发生,必须要阐明不同阶段的、不同细胞的损伤机制。线粒体是细胞能量代谢的核心,为生命活动提供必须的能量,我们的研究已经证实,线粒体损伤以及细胞能量代谢的改变,在再灌注损伤以及心衰进展中发挥重要的作用。但是引起线粒体损伤,调控线粒体代谢改变的上游信号目前并不清楚。因此,探究再灌注损伤中微循环内皮细胞以及心肌细胞在心肌的急慢性期损伤中线粒体的损伤机制,对于改善心肌梗死患者的预后具有十分重要的意义。目的:本研究的主要目的是通过线粒体损伤和线粒体能量代谢,探究再灌注损伤中微循环内皮细胞以及长期缺氧环境中线粒体损伤和线粒体能量代谢改变的机制,阐明微循环破坏以及心肌损伤的机制,以寻求有效的干预测策略,改善患者预后。方法:利用qPCR技术、荧光探针、western blot、病毒过表达、突变质粒转染、干扰RNA敲低、免疫荧光共定位染色高效薄层色谱法等技术,观察蛋白转录和表达、线粒体能量代谢、线粒体ROS生成、线粒体cyt-c渗出、心磷脂氧化、线粒体膜电位、mPTP开放、线粒体凋亡通路、线粒体呼吸链复合酶活性等变化,明确线粒体损伤和能量代谢改变在心脏急、慢性损伤中的作用及其上游的调控机制。结果:1.氧化应激损伤通过诱导的IP3R依赖[Ca2+]c超载导致CMECs凋亡。2.IP3R依赖的[Ca2+]c超载通过激活VDAC介导的[Ca2+]m超载,导致线粒体结构和功能破坏。3.在H202作用下,褪黑素通过激活MAPK/ERK,发挥对CMECs的保护作用。4.缺氧损伤参与心肌细胞中miR-138的表达调节。5.miR-138可以抑制心肌细胞糖酵解并促进线粒体呼吸。6.PDK1是miR-138的直接作用靶点。7.缺氧损伤通过增加糖酵解和减少线粒体呼吸,抑制心肌细胞活力。8.缺氧条件下,过表达miR-138可通过靶向作用PDK1,增强心肌细胞活力。结论:1.钙作为IP3R升高的传递信号,通过VDAC广泛渗透到线粒体中,导致线粒体钙超载,导致线粒体结构和功能的崩溃。2.褪黑素可刺激失活CREB的MAPK/ERK,下调IP3R/VDAC表达,促进[Ca2+]c/[Ca2+]m稳态,阻断线粒体依赖的细胞死亡通路。3.长时间暴露于缺氧环境下,miR-138的表达受到显著抑制,而过表达MiR-138可以保护人类心肌细胞免受缺氧影响。4.MiR-138通过直接靶向作用于PDK1,抑制糖酵解,促进线粒体呼吸。5.缺氧通过增加糖酵解和减少线粒体呼吸引起心肌细胞死亡。6.慢性缺氧刺激下,通过糖酵解抑制剂或抑制PDK1抑制糖酵解,有助于心肌细胞存活。7.在miR-138过表达的心肌细胞中恢复PDK1的表达可提高细胞对缺氧的敏感性。
【学位单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R54
【部分图文】：

图１：原代ＣＭＥＣｓ的形态特点。Ａ：ＡＤＭＳＣｓ呈梭形和鹅卵石样形态。Ｂ－Ｃ：免疫荧光结果显??示，ＣＭＥＣｓ对ＣＤ３１呈单形阳性，能够吸收ＤｉＬ－Ａｃ－ＬＤＬ。??３．２褪黑素对ＣＭＥＣｓ活性和增殖能力的影响??

黑素（１、２、５、１０?ｐｍ／Ｌ）对ＣＭＥＣｓ进行处理和干预，然后分别在处理后的第１、２、??３、４、５、６、７天，我们使用ＣＣＫ－８试验来评估在褪黑素治疗下ＣＭＥＣｓ的生长动??力学。如图２ｂ所示，随着褪黑素浓度的增加，ＣＭＥＣｓ的生长能力逐渐增强。然??而，在前２４小时内，两组之间并无显著差异。结果提示我们，褪黑素可以促进??ＣＭＥＣｓ的増殖能力，浓度越高，增殖能力越强。??１５??

黑素干预后，ＣＭＥＣｓ的凋亡水平明显减轻，并且随着剂量的增加，这种抗凋亡??作用越强（褪黑素ｌｐｍ／Ｌ，６８．２６±５．４１％；?２ｐｍ／Ｌ，?５６＿３４±３＿２１％；?５ｐｍ／Ｌ，??２８．４２±５．１７％；?ｌ〇ｎｍ／Ｌ，１８．３３±４．３６％；图３Ａ）。表明褪黑素可能会阻止过氧化氢??对ＣＭＥＣｓ的致命影响。此夕卜，我们通过ＬＤＨ释放和ｃａｓｐａｓｅ３活性检测来进一步证??实褪黑素的抗凋亡作用。如图所示，与空白对照组相比，Ｈ２０２组的ＬＤＨ释放量??明显增加，同时的ｃａｓｐａＳｅ３活性也明显增加，在使用褪黑素千预后明显的逆转了??这些变化。通过ＬＤＨ释放和ｃａｓｐａｓｅ３活性两项平行实验（图３Ｃ－Ｄ）进一步证实了褪??黑素可以抑制Ｈ２０２引起的ＣＭＥＣｓ凋亡，促进ＣＭＥＣｓ的存活。因为使用１０ｇｍ／Ｌ??的褪黑素干预处理，抗凋亡作用最为明显，因此，在以下的实验中，我们使用ｌ〇ｐｍ??／Ｌ的褪黑素来进行干预。??＼?Ｈ２〇２?〇．３ｍＭ??Ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｍｅｌ?ＯｕＭ?Ｍｅｌ?ｌｕＭ?Ｍｅｌ?２ｎＭ?Ｍｅｌ?５ｆｉＭ?Ｍｅｌ?ＩＯｊｉＭ??■??Ｂ?Ｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎ?ｏｆ
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本文编号：2875402