低剂量阿司匹林通过COX-1和补体凝血途径抑制血小板活化参与大鼠盐敏感性高血压的发生发展

发布时间：2020-11-12 15:26

　　 目的:阿司匹林作为一种有效的抗血小板药物,已广泛应用于心肌梗死、脑卒中等多种心血管疾病的预防和治疗,但在盐敏感性高血压中的作用目前仍不清楚。盐敏感性高血压发病机制复杂,与肾脏排钠障碍、交感神经兴奋性增加以及免疫系统异常等相关。最新研究发现,血小板异常活化能够通过诱导炎症反应参与内皮功能损伤、血管硬化和血管炎症等血管病变,可能促进盐敏感性高血压的发生发展。临床研究也发现,盐敏感性高血压患者体内血小板活性增强。本研究旨在探讨阿司匹林是否能够通过抑制血小板异常活化参与盐敏感性高血压的发生发展,并探讨阿司匹林的作用机制,以期为盐敏感性高血压及其靶器官损伤的防治提供新的理论依据和治疗靶点。方法:在体实验:SPF级雄性盐敏感性高血压大鼠(Dahl salt-sensitive rat,,DSS)及其对照血压盐耐受性大鼠(SS-13BN)分别以正常盐(Normalsalt,NS,0.4%NaCl)、高盐(High salt,HS,8%NaCl)以及高盐合并阿司匹林(High salt+Aspirin,HS+ASA,10mg/kg/d)喂养8周,期间采用尾袖法连续测量血压(3次/周),实验结束后采用颈总动脉插管校正大鼠动脉血压(Blood pressure,BP);流式细胞术检测外周血中血小板的活化率、白细胞-血小板聚集率、以及白细胞浸润血管的百分率;尾血测定实验以及血小板胶原静态黏附实验检测血小板活化情况;免疫组化和HE染色检测肾脏白细胞浸润情况以及肾脏病理结构改变;使用Power-lab系统进行乙酰胆碱(Acetylcholine,Ach)依赖的血管收缩以及舒张功能的检测;Western blot检测血管功能相关性蛋白eNOS、iNOS、vWF、ET-1的表达以及肾脏炎症因子IL-6、IL-1β、TNF-α的表达;酶联免疫吸附法(ELISA)检测外周血清中可溶性血栓素TXA2的表达量情况;Real-time PCR检测IL-6、IL-1β、TNF-α的表达量以及血小板中COX-1、COX-2的mRNA的表达;利用蛋白组学分析的方法检测不同的饮食处理对DSS大鼠血小板蛋白表达的影响。细胞实验:体外分离并富集大鼠的外周血白细胞以及血小板,使用荧光染料BCF-AM对白细胞进行染色,分别用阿司匹林、COX-1抑制剂、COX-2抑制剂对血小板进行预处理,将染色的白细胞和预处理过的血小板分别与正常盐(133 mM NaCl)、高盐(173 mM NaCl)环境的下肺微血管内皮细胞(PMVEC)共孵育,通过荧光倒置显微镜观察白细胞和内皮细胞的黏附情况。结果:DSS大鼠经高盐喂养之后,血压较正常盐组显著升高,阿司匹林干预之后血压与高盐组相比显著降低(P0.05),而SS-13BN大鼠在不同处理(正常盐、高盐、高盐加阿司匹林)下血压无明显变化;流式细胞结果显示,高盐组DSS大鼠外周血的血小板活化率显著增加,白细胞与血小板聚集率较对照组显著增加,阿司匹林灌胃之后,血小板的活化以及与白细胞的聚集率恢复至对照组水平(P0.05);免疫组化结果显示,高盐饮食增加了肾脏白细胞的浸润,阿司匹林干预能够显著改善上述情况;血管功能检测结果显示,高盐饮食之后,DSS大鼠血管收缩和舒张功能明显减弱,而阿司匹林处理之后能够有效改善血管功能(P0.05);流式结果显示高盐组较正常盐相比,DSS大鼠血管白细胞浸润增加,蛋白印迹结果显示血管vWF、ET-1、iNOS表达量显著增加、血管eNOS表达量明显减少,高盐加阿司匹林组较高盐组相比能够有效降低血管白细胞浸润,抑制血管vWF、ET-1、iNOS表达量的增加,能够使eNOS的表达恢复正常。Real-time PCR结果显示,高盐组DSS大鼠较正常盐组DSS大鼠肾脏炎症因子表达水平显著升高,阿司匹林处理之后能够降低高盐引起的炎症因子的升高。蛋白组学结果显示高盐饮食激活了血小板内的凝血和补体途径,而高盐的同时给予阿司匹林干预,能够有效抑制DSS大鼠血小板内的凝血补体途径的激活,从而抑制血小板的活化和功能。结论:低剂量阿司匹林可通过抑制血小板内COX-1的活性以及补体凝血途径的激活,抑制血小板活化,减少外周血中血小板和白细胞的聚集,减少炎症细胞向肾脏及血管组织的浸润,减轻肾脏炎症反应及血管内皮功能障碍,进一步改善DSS大鼠由高盐饮食诱导的盐敏感性高血压的发生与发展。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R544.1
【部分图文】：

降低ＤＳＳ大鼠由高盐饮食引起的血小板Ｐ－选择素水平的增加（Ｐ?＜０．０５）。在ＳＳ－??１３ＢＮ大鼠中，正常盐组以及高盐组中的可释放的血小板Ｐ－选择素水平比ＤＳＳ大鼠??低得多，并且阿司匹林干预似乎对血小板Ｐ－选择蛋白的释放没有显著影响（图２Ａ??和２Ｂ）。另外，我们还进行了尾血测定实验来检测大鼠体内血小板活化情况。结果??显示，三组大鼠在出血时间上无明显差异，即正常盐组为３６８．８±２０．７秒，高盐组为??３７８±２９．１秒，高盐＋阿司匹林组为３５９±１８．９秒（图２Ｃ）。但是，进行高盐饮食的ＤＳＳ??大鼠的血凝块稳定时间（３２６±１９．７秒）要比正常盐饮食的ＤＳＳ大鼠（１９９±１９．６秒）??更长，而阿司匹林干预使得ＤＳＳ大鼠的血凝块稳定时间（１８７±２１秒）恢复至对照??组的水平（图２Ｃ）。此外，血小板胶原静态黏附实验也表明，高盐饮食使得血小板??活化度增强，其与固定化胶原之间的粘附显著增加，通过阿司匹林干预后黏附明显??减少（图２Ｄ）。以上结果均证实了阿司匹林能够抑制ＤＳＳ大鼠外周血中由高盐饮食??引起的血小板异常活化，进而减少了血小板与胶原之间的黏附。但血液学分析结果??显示

同的饮食处理似乎对它们的浸润情况没有明显影响（补充数据图２）。另外，透射??电子显微镜（ＴＥＭ）所观察的结果也显示，来自正常盐组和阿司匹林组的ＤＳＳ大鼠??的主动脉有着完整的内皮层（图４Ｃ）但是高盐组的ＤＳＳ大鼠的主动脉内皮层遭到??破坏，显示出变形的内皮细胞形态以及浸润的白细胞（图４Ｃ），同时，高盐饮食也??增加肾脏中炎性因子ＩＬ－１（３，?ＩＬ－６和ＴＮＦ－ａｍＲＮＡ?（图４Ｅ）和蛋白质（图４Ｆ和４Ｇ）??在肾中的表达，使用阿司匹林进行干预后，肾脏中炎症因子（ＩＬ－ｉｐ，ＩＬ－６、ＴＮＦ－ａ）??在基因水平以及蛋白水平的表达均恢复至正常水平。??Ａ?ＮＳ?ＨＳ?ＨＳ＋ＡＳＡ??一?？?＊■?一？？?＊?ｉ??’?Ｉ，■?－?ｄ?＃?－?ＮＳ?ＨＳ?ｈｓ＋ａｓａ??＋?！?￣＊?．?１?￣￣?＾?＊?ＦＴＴＣ－ＣＤ３ｅ＋??ｉ〇Ｔｆ〇?ｉｎｐｒ￡：：ｉ??？?＂?■?工??Ｐ？ｒ｜？－ｃｙ５．５?ＣＤ４５＋?＋?■—?二???３??｜?＾?－??？■?？，?？＊?－？?Ｊ?－

图５．阿司匹林改善了?ＤＳＳ大鼠由高盐饮食引起的血管功能障碍。??Ｆｉｇｕｒｅ?５．?Ａｓｐｉｒｉｎ?ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ?ｔｈｅ?ｖａｓｃｕｌａｒ?（ａｏｒｔａ）?ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ?ｃａｕｓｅｄ?ｂｙ?ＨＳ?ｄｉｅｔ?ｉｎ?ＤＳＳ?ｒａｔｓ??Ａ．使用Ｐｏｗｅｒ－Ｌａｂ系对由乙酰胆碱（Ａｃｈ）诱导的血管舒张进行定量检测，正常盐组（ＮＳ，ｎ?＝??５），高盐组（ＨＳ，?ｎ＝５），高盐＋阿司匹林组（ＨＳ＋ＡＳＡ，ｎ＝５）。Ｂ．使用透射电子显微镜（ＴＥＭ）??对ＤＳＳ大鼠主动脉进行成像。ＥＣ：内皮细胞；ＳＭＣ：平滑肌细胞；ＩＥＬ，内弹性薄层，标尺：２??呵。Ｃ－Ｄ．?Ｗｅｓｔｅｒｎ?ｂｌｏｔ?（免疫印迹）检测ＤＳＳ大鼠主动脉血管损伤标志物的表达，ｅＮＯＳ：内皮型??一氧化氮合酶；ｉＮＯＳ：诱导型一氧化氮合酶；使用ＧＡＰＤＨ蛋白对结果进行校正，＊Ｐ＜０．０１，??高盐组ｖｓ正常盐组，＃Ｐ＜０．０５，高盐组ｖｓ高盐＋阿司匹林组。（ｎ?＝?６只／组）。结果均表不为平??均值±标准误，并使用单因素方差分析的方法进行结果统计。??Ａ．?Ｖａｓｃｕｌａｒ?ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ?ｉｎｄｕｃｅｄ?ｂｙ?Ａｃｈ?ｗａｓ?ｑｕａｎｔｉｆｉｅｄ?ｂｙ?Ｐｏｗｅｒ－Ｌａｂ?ｓｙｓｔｅｍ?（ｎ＝５）．?Ｂ．?Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ??ｅｌｅｃｔｒｏｎ?ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ?（ＴＥＭ）?ｃｒｏｓｓ－ｓｅｃｔｉｏｎ?ｉｍａｇｅｓ?ｏｆ?ｔｈｏｒａｃｉｃ?ａｏｒｔａ?ｏｆ?ＤＳＳ?ｒａｔｓ?ｆｅｄ?ＮＳ，?ＨＳ，?ｏｒ?ＨＳ?ａｎｄ??ａｓｐｉｒｉｎ?（ＡＳＡ）．?ＥＣ，?ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ?ｃｅｌｌｓ；?ＳＭＣ，?ｓｍｏｏｔｈ?ｍｕｓｃｌｅ?ｃｅｌｌｓ；?ＩＥＬ，?
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本文编号：2880908