磷酸酶PHLPP1对心肌损伤后心肌细胞凋亡与心肌炎症纤维化的调控及机制研究

发布时间：2020-11-15 00:19

　　 研究目的:探索1型蛋白磷酸酶Pleckstrin同源序列富亮氨酸重复片段蛋白磷酸酶(pleckstrin homology(PH)domain leucine-rich repeat protein phosphatase 1,PHLPP1)在急性心肌梗死(myocardial infarction,MI)及阿霉素导致的心肌损伤病理发展过程的凋亡、炎症及纤维化中的作用及机制研究。研究方法:(1)选用8~12周野生型(Wild-type,WT)和PHLPP1 KO小鼠构建冠状动脉左前降支永久结扎急性心肌梗死模型或腹腔注射阿霉素心肌损伤模型,记录小鼠生存情况,第7天及第14天进行超声心动图检测小鼠心功能指标,28天后处死小鼠取心脏组织进行Masson染色比较WT和KO小鼠心肌组织纤维化程度。(2)选用8~12周WT和KO小鼠构建急性心肌梗死模型,5天后处死小鼠采用TTC染色比较WT和KO小鼠心肌组织梗死面积。(3)选用8~12周WT和KO小鼠构建阿霉素心肌损伤模型,第5天小鼠眼球取血测定血清乳酸脱氢酶(LDH)活性比较WT和KO小鼠心肌损伤程度,取心脏组织进行TUNEL染色测定心肌组织中细胞凋亡水平。(4)选用8~12周WT和KO小鼠构建急性心肌梗死模型或阿霉素心肌损伤模型,模型构建后选择适当时间点分离小鼠心脏,采用Western blot、qPCR方法比较WT和KO小鼠心脏组织中炎性因子、纤维化因子、自噬相关蛋白和Bcl-2家族凋亡相关蛋白的蛋白水平及mRNA水平。(5)分离WT和KO新生1~3天小鼠的心肌细胞进行体外培养,培养合适时间后进行阿霉素刺激,进行后续实验:进行流式细胞分析比较WT和KO小鼠心肌细胞凋亡水平的差异,进行PHLPP1及其靶蛋白Mcl-1的免疫共沉淀实验研究二者在细胞内的相互作用,同时采用Western blot方法比较相同刺激时WT和KO小鼠心肌细胞Mcl-1蛋白水平的变化差异。(6)分离WT和KO新生1~3天小鼠的心肌细胞进行体外培养,培养合适时间后进行阿霉素、蛋白翻译抑制剂CHX及蛋白酶体抑制剂MG132干预,WT和KO组分别分为4组,即DOX组,DOX+4h CHX组,DOX+8h CHX组,DOX+8h CHX及MG132组,采用Western blot方法比较Mcl-1蛋白水平的变化差异。结果:(1)PHLPP1缺陷减少急性心肌梗死诱导的小鼠死亡,减轻心肌损伤和纤维化的程度,改善心功能。(2)PHLPP1缺陷减少阿霉素诱导的小鼠死亡,减轻心肌损伤及心功能不全。(3)PHLPP1缺陷减少急性心肌梗死或阿霉素诱导的心肌细胞的凋亡。(4)PHLPP1缺陷减少阿霉素诱导的心肌损伤后炎症因子及纤维化因子表达的增加程度。(5)PHLPP1缺陷不影响心梗后心肌组织中的自噬水平。(6)PHLPP1缺陷上调抗凋亡蛋白Mcl-1的蛋白水平及其Thr163位点的磷酸化水平。(7)PHLPP1能够直接结合Mcl-1,降低其Thr163位点的磷酸化水平,从而促进Mcl-1蛋白酶体途径的降解。结论:我们的研究结果表明PHLPP1能够通过直接结合Mcl-1降低心肌损伤所致的Thr163位点磷酸化水平的升高,从而促进Mcl-1蛋白酶体途径的降解,增加心肌细胞凋亡,加重心脏损伤。本研究发现了PHLPP1对心肌损伤调控的新机制,揭示了PHLPP1通过结合Mcl-1调控其Thr163位点磷酸化的过程,并以此解释了PHLPP1加速Mcl-1降解的分子机制,为将来利用PHLPP1拮抗剂作为药物治疗缺血再灌注及阿霉素相关心肌损伤提供了有力的实验依据。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.2
【部分图文】：

学位论文敲除小鼠的心肌梗死面积（图 1B 下）相比对照野生型小asson 染色显示心肌梗死后 28 天，PHLPP1 基因敲除小于野生型小鼠，表明心肌组织纤维化显著减轻（图 1C心功能指标，如左心室射血分数（Left Ventricular Eje室缩短分数（Left Ventricular Fractional Shortening ，径（Left ventricular internal diameter end systole，LVIDeft ventricular internal diameter end diastole ，LVIDd）、entricular End-Systolic Volume ，LVESV）和左心室舒张d-Diastolic Volume，LVEDV）均较野生型小鼠显著改善脏收缩功能和舒张功能均优于野生型小鼠。以上结果表肌梗死诱导的心肌损伤和心功能障碍，从而减少小鼠

PP1 缺陷减少阿霉素诱导的小鼠死亡，减轻心肌损伤及心 knockout recovers survival and alleviates cardiac injuryilatation after doxorubicin (Dox) treatment. A, Survival ofsham treatment (WT-sham, KO-sham) or Dox treatment (WTDH activity assessment of serum from mice 5 days after sham c systolic function and ventricular dilation shown by LVEd(mm), LVESV(μL) and LVEDV(μL) from transthoracic echoceline and 7,14 days after sham or Dox treatment. ** P<0.01, NLPP1 缺陷降低急性心肌梗死或阿霉素诱P1 缺陷能改善心梗或阿霉素给药后的心肌损伤程度心肌细胞的损伤包括凋亡密切相关，因此我们进一

3. PHLPP1 缺陷降低心梗或阿霉素诱导的心肌细胞的凋亡 knockout mitigates cardiac apoptosis after Dox treatmentuantification of terminal deoxynucleotidyl transferase dUTPand KO mice hearts 5 days after sham or Dox treatment. *and quantification of WT and KO in vitro isolated primary ca<0.01.HLPP1 缺陷降低心肌损伤后炎症因子及纤程度。阿霉素 1 周或 2 周后的小鼠取心脏组织，提取组织 R因子 mRNA 表达水平并比较 PHLPP1 基因缺陷与野录水平有无差异，比较结果发现，PHLPP1缺陷小鼠心
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本文编号：2884104