C反应蛋白加重心肌缺血再灌注损伤的机制研究及他汀的心肌保护作用

发布时间：2020-11-17 08:51

　　 近年来心绞痛、急性心肌梗死等缺血性心脏病(ischemic heart disease)的发病率居高不下。溶栓、早期经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)等方法的广泛应用,使缺血的心脏能够在短时间内重新获得血液灌注并恢复氧供,从而有利于病情的好转;然而再灌注有时反而会加重心脏的结构及功能障碍,这种现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury,MIRI),临床中可表现为恶性心律失常、心功能不全甚至猝死等情况,严重危害患者健康。因此,MIRI一直是心血管医疗工作者关注的焦点话题之一。如何使再灌注治疗在尽早恢复缺血冠脉血流的同时,尽可能地减少再灌注损伤,已经成为了冠心病,特别是急性心肌梗死治疗中亟待解决的关键问题。MIRI是多种因素共同参与的复杂过程,线粒体膜通透性改变、钙超载或钙再分布、氧自由基生成、补体系统激活等机制是形成MIRI的重要原因。其中,线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)与ATP敏感性钾通道(ATP sensitive potassium channel,K_(ATP))均与缺血再灌注这一过程紧密相连。K_(ATP)通道主要分为细胞膜K_(ATP)(sarcolemmal K_(ATP))通道和线粒体K_(ATP)(mitochondrial K_(ATP),mitoK_(ATP))通道。mPTP开放导致的线粒体膜通透性改变是缺血再灌注时各种损伤的汇聚点,而mitoK_(ATP)通道的开放则可以通过逆转钙超载、稳定细胞膜等机制减少MIRI,发挥心肌保护作用;并且mitoK_(ATP)通道的开放可以抑制mPTP开放,从而阻断mPTP下游凋亡蛋白酶激活的级联反应,抑制心肌细胞凋亡。C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)是最先发现的一种急性时相蛋白,由于其能在钙离子存在时与肺炎球菌C型多糖发生沉淀反应而得名。生理条件下体内的CRP含量非常低,当出现急性炎症或组织损伤时,CRP浓度急剧升高,因此CRP最早主要用于检测和评估急性损伤与炎症的发展程度。上世纪80年代,有研究发现CRP增高可以预测未来发生冠状动脉事件的几率,从而引起了广大医生特别是心血管内科医生的高度关注。随后,许多大型流行病学调查及实验研究支持CRP成为动脉粥样硬化、冠心病以及缺血性脑卒中等心脑血管疾病发生、发展强有力的预测因子。不仅如此,越来越多的研究表明,CRP可能直接参与了动脉粥样硬化的形成、发展和演变以及缺血再灌注损伤的过程。然而,CRP作为干预因子,对心肌缺血再灌注这一过程的影响至今少有研究,其发生机制尚不完全清楚。此外,如前所述,mPTP与mitoK_(ATP)通道是缺血再灌注发生过程中的两个重要的相关作用位点。mitoK_(ATP)开放剂二氮嗪(diazoxide)与mPTP阻断剂环孢菌素A(cyclosporin A,CsA)均可以减少MIRI的发生,而CRP与缺血再灌注时mitoK_(ATP)、mPTP的关系目前尚不知晓。通过对上述问题的研究,有可能为日后减少心肌缺血再灌注损伤的发生提供新的治疗靶点,从而使更多的患者从再灌注治疗中获益。其次,细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)、Jun N端激酶/应激活化的蛋白激酶(Jun N-terminal kinase/Stress Activated Protein Kinase,JNK/SAPK)和磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氛酸-苏氨酸蛋白激酶(Phosphatidyl Inositol 3-kinase/serine-threonine kinase,P13K/Akt)通路是机体内重要的信号传导通路,均与缺血再灌注这一过程紧密相关。发生心肌缺血再灌注损伤时CRP对上述通路有何种影响的相关报道尚少。通过对此问题的研究,可以帮助我们较为深入地探讨CRP影响心肌缺血再灌注损伤的作用机制,以便为减少缺血再灌注损伤提供充分的理论基础。另外,他汀类药物在冠心病的治疗中占据重要地位,其除了具有降低血脂的作用以外,还可以发挥独立于降脂作用之外的效应,如抑制炎症反应、改善内皮功能、稳定动脉粥样斑块等。缺血再灌注损伤与他汀多效性均为本课题组多年来的研究领域。证据表明,病理水平的CRP能够直接参与动脉粥样硬化的进程,我们预测CRP亦可能会促进心肌缺血再灌注损伤的发生,如果此结论被证实,则降低CRP水平即可减少缺血再灌注损伤,因而能够为减少缺血再灌注损伤提供新的治疗靶点。虽然目前尚无CRP特异性阻断剂广泛应用于临床,但已有一些相关的基础研究与临床研究显示,阿司匹林、他汀等药物均可以降低CRP水平。如JUPITER大型临床研究表明,对于CRP水平升高的患者,使用他汀类药物能够在大幅降低低密度脂蛋白的同时显著降低CRP水平,从而减少心血管事件的发生。我们课题组在前期研究中发现,他汀类药物能够通过活化mitoK_(ATP)通道、减少活性氧生成和钙超载,进而抑制mPTP的开放等机制减轻心肌缺血再灌注损伤。本课题亦将探讨阿托伐他汀(atorvastatin,Ator)对CRP参与后的心肌缺血再灌注损伤如何发挥心肌保护作用。为此,我们拟应用SD新生乳鼠原代培养心肌细胞建立体外氧糖剥夺再灌注模型,通过比较发生缺血再灌注时有无CRP干预后心肌细胞活力及乳酸脱氢酶(LDH)活性水平等指标的变化,明确CRP对心肌缺血再灌注损伤的影响。同时,通过对氧糖剥夺再灌注时加用mitoK_(ATP)通道开放剂二氮嗪或mPTP阻断剂环孢菌素A后心肌细胞mPTP开放程度、线粒体膜电位水平等指标的变化,了解CRP与mitoK_(ATP)及mPTP的关系,并探讨CRP对相关信号通路的影响机制,从而为早日研究出CRP特异性阻断剂提供研究基础。此外,通过观察在CRP干预的基础上加用阿托伐他汀共同处理后上述指标的变化,明确他汀类药物对CRP介导的心肌缺血再灌注损伤能否发挥同样的心肌保护作用,从而在临床工作中为高CRP人群减少缺血再灌注损伤的治疗方案提供更为充足的理论依据。第一部分C反应蛋白对SD大鼠原代培养心肌细胞氧糖剥夺再灌注的影响目的:研究作为刺激因子的C反应蛋白能否加重模拟体内缺血再灌注损伤过程的原代培养心肌细胞的氧糖剥夺再灌注损伤。方法:选择出生1-2天的SD大鼠,通过建立氧糖剥夺再灌注损伤模型模拟体内的心肌缺血再灌注损伤,心肌细胞进行氧糖剥夺3h,再灌注1h。CRP使用浓度的确定:以往的研究中使用的C反应蛋白浓度通常在5μg/mL至50μg/mL之间。因此,我们测试了不同CRP作用浓度对缺血再灌注的影响。通过MTS测定表明,在氧糖剥夺前给予10ug/mL的CRP进行预处理,即可以明显加重心肌缺血再灌注损伤。新生SD大鼠原代培养的心肌细胞随机分组如下:1.control组:使用含10%FBS的DMEM高糖培养基,在37℃、5%CO_2培养箱中培养的原代心肌细胞。2.OGD/R组:给予氧糖剥夺3h,再灌注1h。3.CRP+OGD/R组:先向细胞培养液中加入10μg/mL的CRP孵育24h,再进行OGD/R。进行OGD/R后,通过MTS检测细胞活力,通过比色测定法测定细胞培养液中LDH漏出率,以了解心肌受损程度。采用钙黄绿素-AM(calcein/AM)和氯化钴(CoCl_2)共同孵育法及激光扫描共聚焦显微镜(laser scanning confocal microscopy,LSCM)技术,测定各指标干预下的mPTP开放程度;采用四甲基罗丹明乙酯Tetramethylrhodamine ethylester(TMRE)孵育法及LSCM技术测定线粒体膜电位水平的变化。结果:1.CRP干预对氧糖剥夺再灌注时心肌细胞活力的影响通过MTS检测心肌细胞活力,每个组别以所测结果与control组相比的百分数表示。经过OGD/R处理后,心肌细胞活力可下降至82.36%±6.18%(P=0.0031)。此外,与OGD/R组相比,CRP预处理组可进一步显著降低心肌细胞活力,达到了对照组的64.84%±4.06%(P=0.0007)。2.CRP干预对心肌细胞LDH水平的影响与control组比较,OGD/R组心肌细胞上清液中的LDH水平明显上升(95.10 U/L±21.57 U/L versus 145.30 U/L±16.06 U/L,P=0.0319)。而给予CRP预处理后,LDH数值进一步升高(208.20 U/L±19.23 U/L),其差异也具有统计学意义(P=0.0122)。3.CRP干预对mPTP开放程度的影响每组以所测结果与control组相比的百分数表示。与control组相比,OGD/R组心肌细胞绿色荧光强度明显减弱(60.93%±2.82%,P0.0001)。给予CRP干预的OGD/R组的荧光强度则进一步显著下降(33.08%±3.48%,P0.0001)。4.CRP干预对线粒体膜电位的影响每组以所测结果与control组相比的百分数表示。OGD/R组心肌细胞红色荧光强度(57.26%±2.95%)明显低于control组,其差异具有统计学意义(P0.0001)。而给予CRP干预后,其荧光强度进一步显著减弱(33.31%±2.03%,P0.0001)。结论:1.CRP的干预明显降低了OGD/R后的心肌细胞活力。2.CRP的干预增加了OGD/R后细胞培养液中的LDH水平。3.CRP的干预使OGD/R时mPTP开放程度增加。4.CRP的干预明显降低了OGD/R时的线粒体膜电位水平。5.CRP加重了心肌细胞的氧糖剥夺再灌注损伤。第二部分C反应蛋白与氧糖剥夺再灌注损伤发生时mitoK_(ATP)、mPTP通道的关系及对信号通路的影响目的:探讨CRP与发生心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤时mitoK_(ATP)、mPTP通道的关系,并探讨CRP对于心肌细胞氧糖剥夺再灌注相关信号通路的影响,即了解CRP加重心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的可能机制。方法:从新生SD大鼠分离并培养原代心肌细胞,建立氧糖剥夺再灌注模型。心肌细胞进行氧糖剥夺3h,再灌注1h。新生大鼠心肌细胞随机分组如下:1.control组:使用含10%FBS的DMEM高糖培养基,在37℃、5%CO_2培养箱中培养的原代心肌细胞。2.OGD/R组:给予氧糖剥夺3h,再灌注1h。3.CRP+OGD/R组:先向细胞培养液中加入10μg/mL的CRP孵育24h,再进行OGD/R。4.CRP+CsA+OGD/R组:培养的心肌细胞先与10μg/mL的CRP共同孵育24h,然后进行3h的OGD。在再灌注开始时,加入10μM的环孢菌素A与心肌细胞孵育20min,继续再灌注共1h。5.CRP+Diazoxide+OGD/R组:培养的心肌细胞先与10μg/mL的CRP共同孵育24h,在进行OGD/R前,加入100μM的二氮嗪共同孵育90分钟,再进行OGD/R。进行OGD/R后,通过MTS检测细胞活力,通过比色测定法测定细胞培养液中LDH漏出率,以了解心肌受损程度。采用calcein/AM和CoCl_2共同孵育法及LSCM技术,测定各指标干预下的mPTP开放程度;采用TMRE孵育法及LSCM技术测定线粒体膜电位水平的变化。前三组通过Western blot法检测ERK、JNK等蛋白表达水平的变化,探讨与CRP介导的心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤相关的信号通路。结果:1.环孢菌素A与二氮嗪对CRP介导的心肌细胞活力下降的影响通过MTS分析法测定心肌细胞的活力。每个组别以所测结果与control组相比的百分数表示。CRP干预后的OGD/R组的MTS值比OGD/R组进一步下降(64.84%±4.06%)。而给予环孢菌素A或二氮嗪预处理后,MTS值均有了显著增高(分别为91.30%±5.18%,92.63%±5.74%);与CRP+OGD/R组相比,差异均有统计学意义(P0.0001)。2.环孢菌素A与二氮嗪对CRP介导的LDH水平增高的影响CRP+OGD/R组的LDH水平较OGD/R组明显增高(208.20U/L±19.23U/L versus 145.30 U/L±16.06 U/L,P=0.0122)。而预先给予环孢菌素A或二氮嗪处理后,均能够显著降低LDH水平(分别为92.72U/L±17.56U/L,93.37U/L±23.99U/L,P值分别为0.0015,0.0029)。3.环孢菌素A与二氮嗪对CRP介导的心肌细胞氧糖剥夺再灌注mPTP开放程度增加的影响每组以所测结果与control组相比的百分数表示。OGD/R组心肌细胞的荧光强度较control组减弱,而CRP干预后其荧光强度进一步下降(33.08%±3.48%)。然而,在上述CRP介导的OGD/R的基础上加入了环孢菌素A或二氮嗪,均可以使荧光强度明显增强(分别为:85.09%±4.11%,81.17%±4.13%,P0.0001)。4.环孢菌素A与二氮嗪对CRP介导的心肌细胞氧糖剥夺再灌注时线粒体膜电位下降的影响每组以所测结果与control组相比的百分数表示。CRP+OGD/R组的荧光强度明显减弱(33.31%±2.03%)。而事先给予环孢菌素A或二氮嗪预处理后,均可明显增加荧光强度(分别为77.35%±2.38%,72.26%±2.45%,P0.0001)。4.CRP对发生心肌细胞氧糖剥夺再灌注时信号通路的影响通过Western Blot分析法检测ERK1/2、JNK等信号通路相关的蛋白表达水平。CRP干预后磷酸化ERK1/2和总ERK1/2水平均显著升高,其中又以磷酸化ERK增加的幅度更具有统计学意义(93.53%±1.94%和170.4%±3.00%,P0.0001)。然而,与OGD/R组相比,在经过CRP干预后,p38MAPK和JNK的表达水平没有显著变化。结论:1.mPTP抑制剂环孢菌素A及mitoK_(ATP)通道开放剂二氮嗪能够抵消CRP引起的上述变化,证明mPTP和mitoK_(ATP)都参与了CRP介导的心肌氧糖剥夺再灌注损伤。2.CRP能够通过激活ERK加重心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤。第三部分阿托伐他汀对C反应蛋白介导的心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的心肌保护作用及机制探讨目的:研究阿托伐他汀预处理对CRP介导的原代SD大鼠心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤是否具有保护作用及其可能的发生机制。方法:从新生SD大鼠分离并培养原代心肌细胞,建立氧糖剥夺再灌注模型。心肌细胞进行氧糖剥夺3h,再灌注1h。随机分为以下几组:1.control组:使用含10%FBS的DMEM高糖培养基,在37℃、5%CO_2培养箱中培养的原代心肌细胞。2.OGD/R组:给予氧糖剥夺3h,再灌注1h。3.CRP+OGD/R组:先向细胞培养液中加入10μg/mL的CRP孵育24h,再进行OGD/R。4.Ator+CRP+OGD/R组:培养的心肌细胞先与1μM的阿托伐他汀孵育3h,再与10μg/mL的CRP共同孵育24h,然后再进行OGD/R。进行OGD/R后,通过MTS检测细胞活力,通过比色测定法测定细胞培养液中LDH漏出率,以了解心肌受损程度。采用calcein/AM和CoCl_2共同孵育法及LSCM技术,测定各指标干预下的mPTP开放程度;采用TMRE孵育法及LSCM技术测定线粒体膜电位水平的变化。通过Western blot法检测ERK、Akt、JNK等蛋白表达水平的变化,结果:1.Ator预处理对CRP介导的OGD/R发生时心肌细胞活力的影响每组以所测结果与control组相比的百分数表示。与CRP+OGD/R组相比,加用Ator预处理后明显增加了心肌细胞活力(64.84%±4.06%versus98.61%±5.01%,P0.0001)。2.Ator预处理对CRP介导的OGD/R发生时LDH水平的影响CRP干预后的OGD/R组的LDH水平(208.20U/L±19.23U/L)较control组(95.10U/L±21.57U/L)、单纯OGD/R组(145.30U/L±16.06U/L)均明显升高。加用Ator预处理后则可以使LDH水平显著下降(94.35U/L±14.83U/L),与CRP+OGD/R组相比,其差异具有统计学意义(P=0.0013)。3.Ator预处理对CRP介导的OGD/R发生时mPTP开放程度的影响每组以所测结果与control组相比的百分数表示。OGD/R组荧光强度低于control组,CRP+OGD/R组荧光强度又比OGD/R组进一步下降。而事先给予Ator干预后的荧光强度明显高于CRP+OGD/R组(92.74%±2.47%versus 33.08%±3.48%,P0.0001)。4.Ator预处理对CRP介导的OGD/R发生时线粒体膜电位的影响各个实验组数据以所测得的红色荧光强度与control组荧光强度的百分数来表示。与OGD/R组相比,CRP干预后的荧光强度进一步减弱(33.31%±2.03%)。而在此基础上加用Ator干预,则抵消了上述CRP的影响,即荧光强度显著增高(84.00%±2.31%,P0.0001)。Ator预处理抑制了CRP介导的线粒体膜电位的下降。5.Ator预处理对CRP介导的OGD/R发生时信号通路的影响通过Western Blot分析法检测各个干预组ERK1/2、Akt、JNK等信号通路相关蛋白的表达水平。与单纯CRP介导的OGD/R组相比,加用Ator预处理后可以使Akt表达明显增加(122.7%±5.30%versus 184.2%±6.96%,P=0.0003)。此外,与单纯CRP介导的OGD/R组相比,加入Ator可以使ERK和磷酸化ERK表达水平均降低,其中又以对磷酸化ERK的影响更为显著。综上所述,Ator能够激活Akt信号通路及降低磷酸化ERK表达水平。结论:1.Ator预处理增加了CRP介导的OGD/R发生时的心肌细胞活力,具有心肌保护作用。2.Ator预处理明显减少了CRP介导的OGD/R发生时的LDH水平。3.Ator预处理降低了CRP介导的OGD/R发生时的mPTP开放程度。4.Ator预处理增加了CRP介导的OGD/R发生时的线粒体膜电位水平。5.Ator通过激活Akt及减少ERK表达而发挥对CRP介导的心肌细胞氧糖剥夺再灌注损伤的心肌保护作用。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

图 1 本部分的实验方案OGD/R：氧糖剥夺再灌注；CRP：C 反应蛋白Fig.1 The experimental program in this section. OGD/R: oxygen-glucodeprivation/ reoxygenation. CRP: C- reactive protein.

图 2 不同时期新生 SD 大鼠心肌细胞的形态学观察(A)差速贴壁后；(B)培养 24 小时；(C)培养 48 小时；(D)培养 72 小时Fig.2 The morphological observation of myocardial cells in newborn SD ratsat different times. (A) After differential attachment. (B) After 24h. (C) After

图 3 采用 α-actin 免疫组化法鉴定心肌细胞ells were identified by α-actin immunohistochemistry
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本文编号：2887306