脂筏及其受体在反式脂肪酸诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡机制中的作用

发布时间：2020-11-20 00:34

　　 心血管疾病是在全世界死亡率和发病率最高的一个疾病之一。在我国，肥胖和高血压人口达2亿6千万，每年有300万人死于心脑血管疾病，尤其是动脉粥样硬化。我国居民摄食油脂较高，远超过了营养学会推荐的水平。氢化油做为食品加工中常用的油脂，其中反式脂肪酸的含量较高。研究表明，高TFAs摄入除了通过升高血清LDL和TG，引起血管内皮损伤外，还可提高可溶性细胞间黏附分子－1（SICAM-1）、可溶性血管细胞黏附分子－1（SVCAM-1）和E－选择素（E-selectin）的表达。虽然有很多研究都报道了TFAs与心血管疾病有关系，但TFAs对血管的影响机制尚不清楚。有学者发现广泛存在于中国日常膳食中的反油酸（9t18:1）和反亚油酸（9t12t18:2）能通过Caspase途径诱导血管内皮细胞凋亡、促进内膜炎性因子释放。流行病学研究已经证实这两种TFAs诱导动脉粥样硬化（AS）程度具有显著差异。近年来的研究表明，脂筏内富含脂类和一些与细胞信号转导有关的组分，这可能就为信号转导的有效进行和各种信号转导途径的“cross talk”提供平台。已有文章报道，多不饱和脂肪酸如二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等可以改变脂筏结构，DHA还可改变脂筏脂肪环境调节白细胞介素2受体信号通路。因此猜测TFAs对细胞的影响可能与脂筏结构有关，一方面可能通过改变脂筏脂肪酸和磷脂组成而影响细胞，一方面可能通过刺激脂筏上受体而诱导细胞凋亡。本研究将对比用脂筏破坏剂破坏细胞膜脂筏与否，TFAs对细胞信号的影响，探讨脂筏及其受体在TFAs引起细胞凋亡中的重要作用，为我国心血管疾病的病因及其防治提供科学依据。 本研究首先建立脂筏破坏模型，确定脂筏破坏剂的合理作用时间，在不引起细胞形态及生理指标变化的情况下，采用MTT法观察9t18:1和9t12t18:2对内皮细胞活力的影响，通过流式细胞术检测TFAs对细胞凋亡和周期的影响，进一步通过Western-Blot分析TFAs对凋亡相关蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）和周期相关蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表达量的影响，探讨脂筏对TFAs诱导细胞凋亡及周期变化的影响。根据前期结果，通过Western-Blot分析脂筏上凋亡受体表达，再运用荧光显微镜观察脂筏上受体变化，最后通过高效气相色谱法分析TFAs对细胞脂肪酸组成的影响，得到反油酸诱导细胞凋亡的受体通路。与此同时，通过以上方法和指标对比了脂筏在不同饱和度TFAs诱导细胞生理变化中的介导作用。主要取得如下研究成果： 1.成功建立脂筏破坏模型。脂筏破坏剂MβCD在作用浓度为10mM时，其不引起人脐静脉内皮细胞活力发生显著变化的时间为60min以内，超过60min内皮细胞微观形态开始改变，甚至细胞死亡。在40min时细胞膜胆固醇含量有明显减低，在50min时脂筏的标志蛋白（小窝蛋白）表达量有显著下降，说明在40-60min时，MβCD即可去除脂筏又不会影响细胞的生理功能，因此确定脂筏破坏剂作用浓度为10mM，作用时间为50min。 2.脂筏参与TFAs诱导的细胞凋亡。TFAs可降低细胞活力，促使细胞凋亡。但TFA作用于去除脂筏的内皮细胞时，细胞活力下降减少，凋亡细胞数降低，凋亡相关蛋白（caspase-3、-8、-9、Bax、Bcl-2、Bid、p53等）表达量下降，且同浓度（50μmol/L）的9t12t18:2对上述指标降低能力比9t18:1大，说明脂筏参与了TFAs诱导的细胞凋亡，且对9t12t18:2引起的凋亡能力更大。 3.脂筏参与TFAs诱导的细胞周期改变。当脂筏功能受干扰后，9t18:1和9t12t18:2均能促进内皮细胞由G0/G1期进入S期，使处于增殖期的细胞数量百分比明显增加；对周期相关蛋白（p21、p27、CDK2、CDK4、CyclinD1等）表达量也有显著影响。 4.9t18:1和9t12t18:2均能增加ICAM-1、VCAM-1、E-selectin等炎症因子表达量，同浓度下反亚油酸促炎效果更强；去除脂筏后，炎症因子表达显著降低，说明破坏脂筏对炎症有抑制作用。 5.9t18:1作用于内皮细胞，可使凋亡受体Fas聚集在细胞膜上，当去除脂筏后，凋亡受体及配体表达下降，其下游凋亡蛋白表达也降低，由此推测反油酸作用于细胞脂筏，刺激Fas受体与其FasL配体结合，并激活下游凋亡通路，引起细胞凋亡。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R54
【部分图文】：

Fig. 1.1 The possible pathway of TFAs induced vascular cell injury上游信号受体还未知，TFAs 是否通过细胞膜上蛋白受体胞周期、细胞凋亡和炎症通路及其他信号通路尚不得而知可见，膳食中 TFAs 含量及摄入量将诱发心血管疾病特别发展，通过研究不同饱和度的 TFAs 对血管壁细胞的影响

图 1.2 脂筏组成及结构Fig. 1.2 Composition and structure of lipid rafts1.3.2 脂筏的信号转导功能观察研究发现，脂筏上存在多种与信号转导有关的特殊蛋白质，使其参

图 2.1 MβCD 不同作用时间对 HUVEC 活力的影响Fig.2.1 Effect of different MβCD reaction time on cell viability of HUVEC注：数据表示为X ±SD，n=6，无 MβCD 作用时细胞存活率设为 100%，*表示有显著差异（p<0.05）.4.2 MβCD 不同作用时间对 HUVEC 微观形态的影响
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本文编号：2890669