低能激光对大鼠心肌梗死后梗死组织中微小RNA-126的表达及血管再生影响的研究

发布时间：2020-11-21 07:49

　　 背景及目的伴随着我国城市化进程加快并且步入老龄化社会,以及广大居民生活方式不健康,2017年中国心血管病报告中指出我国心血管患者超过二亿九千万,心血管病死亡率已超过癌症成为第一致死性疾病。其中心肌梗死死亡率占心血管病死亡60%以上,并且总体呈上升态势。心肌梗死(myocardial infarction,MI)是冠状动脉粥样斑块破裂形成血栓,冠状动脉管腔梗塞,心肌持续缺血、缺氧导致坏死的临床综合征。治疗手段可以分为药物治疗和再血管化治疗。不管何种治疗手段都与梗死心肌血供恢复状况密切相关,因此梗死心肌中新生血管形成多少或原有阻塞血管重新开放,对于心肌梗死的修复具有重要的意义。血管的生成是指通过血管内皮细胞的增殖和迁移,以出芽或套迭的方式生成新的血管。近些年随着对MI过程中病理生理改变的研究不断深入,许多学者想到提高梗死区新生毛细血管的生成治疗MI。近年来,有关微小RNA的研究已经成为医学领域的研究热点并取得了重要进展。微小RNA(microRNA,miRNA)是真核生物中一类内源性高度保守的非编码小分子RNA,可以使目标基因表达增强或抑制。研究报道miRNA作用于机体各种生物反应过程,其中就包括促进血管新生,具有重要的生理和病理意义。miR-126是具有内皮特异性的miRNA,在所有毛细血管和较大的血管内皮细胞中高度表达,通过影响血管基因信号转导通路来调节血管的生成和发育。有研究证实miR-126是血管内皮细胞中表达最丰富的miRNA,特别是在心脏、肺等高度血管化的小鼠组织中。miR-126在维持体内血管内皮细胞和血管完整性方面具有十分积极的作用。低能激光照射疗法(low level laser irradiation,LLLI)是一种十分成熟的物理治疗手段,在医学方面的应用已经有40多年的历史,起初在眼科、骨科领域率先大胆尝试,现已经在几乎所有学科领域中广泛应用,它的安全性和有效性已经得到学术界的证实和认可。LLLI产生生物学效应而非热效应,包括刺激、调节、活化等生物刺激效应。它主要影响损伤组织,对受损细胞有益,包括细胞增殖、粘附改善和防止细胞凋亡,对未受损细胞基本无害。尽管LLLI具体作用机制和作用机理还处于研究阶段,但大量的基础研究和临床案例已经证实其能在体外调节细胞和组织的诸多生物学过程。有研究显示,LLLI能改善了梗死区域的微循环,具有心肌保护作用,还能减弱胶原纤维的形成,改善心室重塑过程。因此,本研究通过建立大鼠心肌梗死模型,观察心肌梗死前后心肌组织中miR-126表达的变化,并采用低能激光照射心梗区域,观察梗死心肌边缘组织中miR-126照射前后表达的变化,以及梗死后新生毛细血管密度的变化,进而探讨低能激光和miR-126是否能共同促进毛细血管的生成,低能激光应用于临床治疗心肌梗死提出可能。材料和方法(1)动物及分组实验动物为SPF级雄性SD大鼠110只,体重体重220-250g,年龄6-8周。随机分为3组:假手术组30只、对照组40只、激光组40只。对照组和激光组大鼠建立心梗动物模型,心梗模型建模方法为将左冠状动脉前降支结扎。假手术组制作方法为术中相同位置穿线但不结扎,余步骤相同。(2)筛选心梗模型大鼠心梗模型建模手术完成24h后,行超声心动图检测,心梗模型的入选标准:客观指标:1.左室射血分数60%;2.左室短轴缩短率30%;主观指标:3.发现至少有1个层面表现出心室壁收缩异常。成功的心梗模型需符合2项及以上。(3)低能激光照射筛选后,对所有大鼠进行LLLI。当假手术组和对照组进行LLLI时,低能激光仪不通电。(4)左心功能检查在大鼠心梗模型筛选时第1次记录,对照组和激光组LLLI后,在获取心肌组织标本前再次行超声心动图检查,检查指标及方法均与第1次相同。(5)测定miR-126表达三组均在低能激光照射后24h、7d、14d时腹腔麻醉,迅速开胸获取标本,排出心腔内血液,确保无残留,用眼科剪小心采集梗死区边缘心肌组织,保存于-80℃冰箱。采用RT-qPCR方法检测miR-126的表达。(6)梗死心肌组织病理分析三组大鼠在低能激光照射后7d时腹腔麻醉,迅速开胸获取标本,用2%TTC磷酸缓冲液进行染色(2-3只/组)、苏木素-伊红染色、CD31免疫组化法检测MVD。(7)统计学方法实验数据应用SPSS 21.0统计软件,计量资料以均数±标准差(x±s)表示析,采用方差分析证明各组方差齐性后采用LSD-t检验,计量资料相关性进行关联性分析,检验水准α=0.05,p0.05说明差异具有统计学意义。结果(1)大鼠建模情况在三组大鼠行建模操作后24h内,共有99只大鼠存活,假手术组29只,对照组30只,激光组35只,建模手术成功率为81.25%(65/80)。经筛选,对照组有28只符合标准,激光组有26只符合标准,心梗模型建立成功率为:67.5%(54/80)。(2)左心功能评价及比较激光组低能激光照射7d后,照射后较照射前左室射血分数、左室短轴缩短率显著提高,差异均有统计学意义;低能激光照射7d后激光组较对照组左室射血分数、左室短轴缩短率显著提高,差异均有统计学意义。(3)梗死心肌miR-126表达miR-126扩增结果示:激光组miR-126的表达较对照组明显增高。假手术组miR-126的表达不随时间推移而改变,总体相对稳定。在低能激光照射后,对照组和激光组miR-126的表达在24h、7d、14d均低于假手术组,而激光组均高于对照组;对照组miR-126表达在7d时最高,激光组同样如此;对照组14d时miR-126的表达量低于24h,但激光组14d时与24h比较无统计学意义。(4)心梗面积比较根据TTC染色结果,发现激光组大鼠心梗面积与对照组相比显著减少,差异具有统计学意义。(5)心肌组织病理学检测结果1.HE染色结果假手术组大鼠心肌细胞排列规整,细胞结构基本正常,未见炎性细胞浸润;对照组出现大量区域性坏死伴有大量炎性细胞浸润;激光组心肌细胞坏死程度和水肿现象较对照组有所改善,炎性细胞浸润减少。2.免疫组化检测结果CD31免疫组化法检测大鼠梗死心肌组织中微血管密度(MVD),结果显示:激光组大鼠心肌组织中微血管密度较对照组有明显增加,差异有统计学意义。(6)激光组miR-126表达与微血管密度的相关性激光组大鼠梗死心肌组织中miR-126的表达水平与微血管密度关联性分析,结果示:激光组大鼠梗死心肌组织MVD与miR-126的表达水平呈正相关。结论低能激光能够促进大鼠心肌梗死后梗死心肌组织的血管再生,新生血管形成后,提升梗死心肌的血供,缩小了心肌梗死面积,减轻梗死过程中的炎性反应,提高左心功能,达到心肌保护的目的。低能激光可以提高梗死心肌中miRNA-126表达,其与血管新生呈正相关,这可能是低能激光影响血管再生的作用机制。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R542.22
【部分图文】：

3 结果.1 大鼠心肌梗死模型建立情况在大鼠心梗模型手术后 24h 内，共有 99 只大鼠存活，其中假手术组存活，对照组存活 30 只，激光组存活 35 只，分析死亡原因为：呼吸衰竭致自主不能恢复、结扎位置过高造成心梗面积过大致急性左心衰、搬动心脏过多动轻柔致恶性心律失常、术后恢复期肺部感染等。心梗模型建立过程中手术成为 81.25％（65/80）。经超声筛选，对照组有 28 只符合标准，激光组有 26合标准，心梗模型建立成功率为：67.5％（54/80）。术中结扎 LAD 后可见部位以下左心室部分心肌颜色变淡，微微发白（图 3.1）。

13图 3.2 低能激光照射后 7d 对照组和激光组 PCR 扩增结果miR-126 扩增情况：激光组 miR-126 表达高于对照组（见图 3.2）3.3.2 miR-126 实时荧光定量 PCR 结果假手术组 miR-126 的表达不随时间推移而改变，总体相对稳定。在低能激光照射后，对照组和激光组 miR-126 的表达在 24h、7d、14d 均低于假手术组（24h假手术组比对照组 T=12.034 P=0.000，假手术组比激光组 T=8.045 P=0.000；7d假手术组比对照组 T=7.998 P=0.000，假手术组比激光组 T=2.585 P=0.049；14d假手术组比对照组 T=7.981 P=0.000，假手术组比激光组 T=4.533 P=0.006），而激光组均高于对照组（24h 激光组比对照组 T=3.076 P=0.028，7d 激光组比对照组 T=2.769 P=0.039，14d 激光组比对照组 T=10.509 P=0.000）；对照组 miR-126表达在 7d 时最高（对照组 7d 比对照组 24h T=7.809 P=0.001，对照组 7d 比对照组 14d T=9.182 P=0.000），激光组同样如此（激光组 7d 比激光组 24h T=5.615P=0.002，激光组 7d 比激光组 14d T=27.336 P=0.000）；对照组 14d 时 miR-126

表达量低于 24h，但激光组 14d 时与 24h 比较无统计学意义（对照组 14d 比对组 24h T=2.779 P=0.039，激光组 14d 比激光组 24h T=0.635 P=0.553）（见表.1 图 3.3）。 3.1 各组大鼠梗死心肌 miR -126 在 LLLI 后不同时段的相对表达水平比较（n=6/时间点组别 24h 7d 14d假手术组 19.25±1.43 19.98±1.75 20.25±2.42对照组 12.42±1.01 15.58±0.83 11.15±0.98激光组 14.00±0.86 17.40±1.16 14.43±1.30
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本文编号：2892755