氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移的影响及机制研究

发布时间：2020-11-21 12:10

　　 研究背景:肺动脉平滑肌细胞的过度增殖、凋亡抵抗以及异常迁移是肺动脉高压肺动脉血管重塑的标志性特点。研究显示Wnt/β-catenin信号通路在肺动脉高压的肺动脉平滑肌细胞增殖中起关键作用。氯硝柳胺是一种广泛应用的抗绦虫感染的药物,在临床上的应用已经超过50余年,研究显示氯硝柳胺在治疗肿瘤中显示出多种多样的抗肿瘤生物学功能,包括抑制肿瘤细胞的增殖和迁移,诱导肿瘤细胞凋亡,氯硝柳胺可影响肿瘤细胞中的多种信号通路,如Wnt/β-catenin、P53信号通路,诱导、增加活性氧产生进而诱导凋亡等。氯硝柳胺是否可抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖、迁移及诱导凋亡尚不清楚,因此,本研究探究了氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞的增殖、迁移及凋亡的作用及其可能的机制。研究方法:氯硝柳胺(0-5μM)分别处理肺动脉平滑肌细胞12 h、24 h、48 h后,应用CCK-8增殖实验研究氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞增殖的影响;EdU增殖实验检测氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞DNA合成的影响;应用划痕实验检测对肺动脉平滑肌细胞迁移的影响。采用Hoechst凋亡染色以及Annexin V-FITC流式细胞仪检测氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞凋亡的诱导作用,流式细胞仪检测其对肺动脉平滑肌细胞的细胞周期的影响,以及肺动脉平滑肌活性氧产生的影响;采用荧光显微镜及流式细胞仪分析检测肺动脉平滑肌细胞线粒体膜电位,以明确氯硝柳胺是否通过影响细胞中活性氧的产生、线粒体膜电位而影响凋亡,采用Western blot实验分析氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞中的cycLin D1蛋白表达,Western blot检测肺动脉平滑肌细胞中凋亡相关蛋白表达,包括caspase-3、caspase-9、Bax、Cytochrome c、p53,Western blot检测Wnt/β-catenin信号通路蛋白表达水平,包括β-catenin、Wnt5a、DVL2、DVL3、Axin1、P-LRP6。研究结果:氯硝柳胺处理12 h、24 h、48 h可抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖。EdU增殖实验发现氯硝柳胺处理24 h后可影响肺动脉平滑肌细胞的DNA合成,对照组EdU阳性细胞百分比为(9.8±0.7)%,0.3μM氯硝柳胺处理组EdU阳性细胞百分比为(3.4±0.7)%,处理组EdU阳性细胞百分比下降了65%。氯硝柳胺可抑制肺动脉平滑肌细胞的迁移。氯硝柳胺可导致肺动脉平滑肌细胞周期紊乱,对照组G0/G1期细胞百分比为(61.98±1.04)%,S期细胞百分比为(27.08±2.88)%,处理组G0/G1期细胞百分比为(72.85±0.52)%,S期细胞百分比为(14.26±1.23)%。氯硝柳胺处理组肺动脉平滑肌细胞的凋亡水平增高。氯硝柳胺处理组肺动脉平滑肌细胞活性氧产生增加。氯硝柳胺处理组肺动脉平滑肌细胞的线粒体膜电位无显著影响。氯硝柳胺导致肺动脉平滑肌细胞中的cycLin D1蛋白表达水平降低。氯硝柳胺可导致肺动脉平滑肌细胞中的caspase-3、caspase-9、Bax、Cytochrome c、p53蛋白表达升高。氯硝柳胺可抑制肺动脉平滑肌细胞中的β-catenin、Wnt5a、DVL2、DVL3、Axin1、P-LRP6蛋白表达。结论:氯硝柳胺可抑制肺动脉平滑肌细胞的增殖、迁移并诱导凋亡;氯硝柳胺诱导肺动脉平滑肌细胞凋亡与p53信号通路的激活及活性氧的产生有关,与影响线粒体膜电位来诱导凋亡的机制无关;氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞的抗增殖作用与诱导细胞周期阻滞在G0/G1期及抑制Wnt/β-catenin信号通路、cycLin D1蛋白表达有关。
【学位单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R544.1
【部分图文】：

图 1.肺动脉高压中肺血管细胞增殖中涉及的信号通路[Pulmonary Circulation 2017; 7:285-299]在寻找新的靶分子治疗肺动脉高压的过程中，可以通过在治疗肿瘤中的药物入手，尤其是那些在临床上应用实践有比较长的时间、临床应用资料较全的药物，因而其安全性可能较高，同样的，相比新药的研发、应用需要一个漫长周期，且需耗费大量的资金，从现有的抗肿瘤药物中寻找药物具有较高的性价比。有学者发现，伊马替尼作为一种治疗慢性粒细胞白血病的药物，被发现可缓解野百合碱诱导的肺动脉高压[8]。有没有其他的药物具有类似伊马替尼的效果能够干预肺动脉高压呢？本研究通过查阅资料，最终本研究发现氯硝柳胺可能具有潜在、类似的作用，氯硝柳胺（nicolsamide）又称灭绦灵，临床上作为抗寄生虫病中的驱绦虫药物已经应用50 余年；文献显示氯硝柳胺具有高效、毒性低的特点，是目前大面积使用的灭钉螺的有效药物，通过影响细胞线粒体功能而起效[9]。而近年来，越来越多的研究显示氯硝柳胺具有抗肿瘤作用，抑制肿瘤细胞的增殖、迁移，诱导凋亡。研究显示，氯硝柳胺可抑制前列腺癌细胞、肺癌细胞的迁移[10, 11]。此外，研究显示，氯硝柳胺可抑制结肠癌细胞的增殖、迁移，并诱导凋亡，同时抑制结肠癌细胞中的 Notch1、

氯硝柳胺对肺动脉平滑肌细胞增殖、迁移的影响及机制 Wnt/β-catenin 信号通路有关，而且氯硝柳胺可诱导肾癌细胞线粒体膜电及活性氧产生的增加[14]。氯硝柳胺可通过干预结肠癌细胞中 Wnt/β-cateni而抑制细胞增殖[15]。氯硝柳胺可抑制乳腺癌细胞中的 Wnt/β-catenin 信号通其增殖[16]。氯硝柳胺可干预肿瘤细胞中中多条信号通路来干预增殖[17]（

treated with different concentrations of niclosamide for 24 hours.氯硝柳胺 0 0.3 M 0.6 M 1.2 M 2.5 M 5 M均值 1.02 0.89 0.73 0.64 0.85 0.50标准差 0.07 0.12 0.07 0.03 0.48 0.04表 3.肺动脉平滑肌细胞经不同浓度氯硝柳胺处理 48 h 后 CCK-8 检测测得的吸光度值。Table3.Absorbance values measured by CCK-8 after pulmonary artery smooth muscle cells weretreated with different concentrations of niclosamide for 48 hours.氯硝柳胺 0 0.3 M 0.6 M 1.2 M 2.5 M 5 M均值 1.34 0.77 0.56 0.47 0.46 0.42标准差 0.10 0.04 0.05 0.03 0.04 0.01
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本文编号：2892976