k-阿片受体激动剂对缺氧复氧损伤H9c2心肌细胞自噬的影响

发布时间：2020-11-23 20:19

　　 目的:通过体外培养H9c2大鼠心肌细胞并建立缺氧复氧模型,观察不同缺氧复氧损伤程度对H9c2心肌细胞自噬的影响,并观察自噬变化对心肌细胞存活率的影响,探讨当前实验条件下研究H9c2心肌细胞自噬最佳的缺氧复氧模型;以选择性κ-阿片受体激动剂U50488H预处理作为干预,观察κ-阿片类物质对缺氧复氧损伤H9c2心肌细胞存活率及自噬的影响,探讨H9c2心肌细胞缺氧复氧过程中κ阿片受体的激活是否具有直接的心肌细胞保护效应以及自噬是否参与其中并发挥作用。方法:培养H9c2大鼠心肌细胞,利用不同缺氧液建立不同损伤程度的缺氧复氧模型,缺氧时将H9c2细胞置于缺氧培养箱,分别以0.5%FBS复合高糖DMEM、无糖培养基、PBS缓冲盐溶液为缺氧液培养3h后置换完全培养基置于正常培养箱中培养3h,观察不同缺氧复氧损伤程度对H9c2心肌细胞形态的影响,MTT法检测各组细胞存活率,MDC荧光染色流式细胞仪检测各组细胞自噬率,实时荧光定量PCR法检测各组细胞内Atg5 mRNA的表达水平;给予浓度分别为0.1 u mol/L、1 u mol/L、10 μ mol/L的U50488H预处理H9c2心肌细胞24h后建立以0.5%FBS复合高糖DMEM为缺氧液缺氧3h复氧3h的缺氧复氧模型,取复氧后心肌细胞,MTT法检测各组细胞存活率,MDC荧光染色流式细胞仪检测细胞自噬率,实时荧光定量PCR法检测细胞内Atg5 mRNA的表达水平。结果:建立H9c2大鼠心肌细胞不同损伤程度缺氧复氧模型的研究中,与空白对照组相比,各H/R模型组细胞存活率均降低,0.5%FBS复合高糖DMEM、无糖培养基、PBS处理各组H/R心肌细胞存活率逐渐下降。流式细胞仪与实时荧光定量PCR的结果显示,与空白对照组相比,各H/R模型组心肌细胞自噬率与Atg5 mRNA的表达差别均有统计学意义;0.5%FBS复合高糖DMEM、无糖培养基、PBS处理各组H/R心肌细胞自噬率与Atg5 mRNA的表达均逐渐下降,其中0.5%FBS复合高糖DMEM、无糖培养基处理组较空白对照组增加,PBS处理组则是下降的。U50488H预处理缺氧复氧损伤H9c2大鼠心肌细胞的研究中,与空白对照组相比,H/R组和U50488H各浓度处理组细胞存活率均降低;与H/R组相比U50488H各浓度处理组细胞存活率差别均无统计学意义。流式细胞仪与实时荧光定量PCR的结果显示,与空白对照组相比,H/R组和U50488H各浓度预处理组心肌细胞自噬率以及Atg5 mRNA的表达均上调;与H/R组相比,U50488H 0.1μmol/L预处理组心肌细胞自噬率和Atg5 mRNA的表达差别均无统计学意义,U50488H 1 u mol/L预处理组心肌细胞自噬率差别无统计学意义,Atg5 mRNA的表达差别则有统计学意义,U50488H110 μ mol/L预处理组心肌细胞自噬率与Atg5 mRNA的表达差别均有统计学意义。结论:利用缺氧培养箱选用0.5%FBS复合高糖DMEM或者无糖培养基作为缺氧液均可建立可行的研究H9c2心肌细胞自噬的缺氧复氧模型,心肌细胞的自噬水平与缺氧复氧损伤的程度相关,适度缺血缺氧可激活自噬,而过度则可抑制自噬。选择性κ-阿片受体激动剂U50488H预处理呈浓度依赖性升高缺氧复氧损伤H9c2心肌细胞的自噬水平,对细胞存活率没有明显影响,提示细胞存活可能受多种因素影响,需要进一步研究。
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