RhoGTP酶在肿瘤坏死因子（TNF-α）诱导内皮细胞损伤中的作用及机制研究

发布时间：2021-01-08 02:56

　　目的体外建立TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞（HUVECs）损伤模型,研究RhoGTP酶在TNF-α诱导内皮细胞损伤中的作用及机制。方法购买人脐静脉内皮细胞（HUVECs）贴壁培养。采用siRNA技术在HUVECs中分别沉默RhoA、Rac1、Cdc42的基因表达,通过RT-PCR法鉴定RhoA、Rac1、Cdc42的沉默。实验采用正常组（control）、模型组（60 ng/ml TNF-α,作用4 h）,应用Western Blot技术和Pulldown assay检测RhoA、Rac1、Cdc42和Raf-1的表达及活化;采用正常组（control）、模型组（60 ng/ml TNF-α,作用4 h）、siRNA或抑制剂组、siRNA或抑制剂预处理+TNF-α处理组,应用MTT法检测细胞存活率,PI/Annexin V-FITC双染色和流式细胞仪检测细胞凋亡,应用Western Blot技术检测ROCK的表达、活化、vimentin（波形蛋白）的表达、裂解、磷酸化以及caspase3、caspase8、caspase9的活化,免疫荧光检测vimentin和phospho-vimen... 

【文章来源】：南通大学江苏省

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 绪论
第二章 材料与方法
    2.1 研究资料及仪器设备
        2.1.1 研究对象
        2.1.2 主要仪器与试剂
        2.1.3 主要溶液配制
    2.2 实验流程与方法
        2.2.1 细胞培养与鉴定
        2.2.2 细胞冻存
        2.2.3 细胞复苏
        2.2.4 实验分组
        2.2.5 MTT法
        2.2.6 免疫荧光
        2.2.7 siRNA转染
        2.2.8 RT-PCR分析
        2.2.9 蛋白样品提取
        2.2.10 蛋白质定量（BCA法）及配平
        2.2.11 Western Blot
        2.2.12 Pulldown assay
        2.2.13 Annexin V-FITC/PI凋亡检测
        2.2.14 流式细胞仪BD Accuri C6日常操作流程
        2.2.15 统计学处理分析
第三章 结果
    3.1 内皮细胞鉴定
    3.2 RhoA、Rac1、Cdc42沉默的筛选及鉴定
    3.3 RhoA沉默显著降低TNF-α诱导的内皮细胞毒性
        3.3.1 RhoA沉默显著提高TNF-α诱导的内皮细胞存活率
        3.3.2 RhoA沉默显著降低TNF-α诱导的内皮细胞凋亡
    3.4 TNF-α诱导Rho A活化，而对Rac1、Cdc42的活化无明显作用
    3.5 RhoA沉默抑制TNF-α诱导ROCK1表达及ROCK活化
        3.5.1 RhoA沉默抑制TNF-α诱导ROCK1表达
        3.5.2 RhoA沉默抑制TNF-α诱导ROCK活化
    3.6 ROCK抑制可减少TNF-α诱导的内皮细胞毒性
    3.7 RhoA/ROCK信号通路介导TNF-α诱导的Vimentin裂解和磷酸化
    3.8 ROCK抑制可减少TNF-α诱导的caspase3和caspase8的活化
    3.9 RhoA/ROCK信号通路介导TNF-α诱导的Vimentin和phospho-Vimentin的重排
    3.10 TNF-α可诱导Raf-1的磷酸化
    3.11 Raf-1抑制不影响ROCK1表达和ROCK活化
    3.12 Raf-1/CK2通路可介导TNF-α诱导的Vimentin和phospho-Vimentin表达，但不影响TNF-α诱导的Vimentin裂解
    3.13 Raf-1/CK2通路可介导TNF-α诱导的Vimentin和phospho-Vimentin的重排
    3.14 Raf-1/CK2通路可介导TNF-α诱导的内皮细胞毒性
第四章 讨论
第五章 结论
参考文献
英文缩写词表
综述
    综述参考文献
在攻读硕士学位期间公开发表的论文与参加的项目
    A：在国内外刊物上发表的论文
    B：所主持的项目
    C：所参与的项目
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]法舒地尔对急性缺血性脑卒中患者血液流变学的影响[J]. 张爱华,全正翔,刘福中.  中南药学. 2008(03)



本文编号：2963769