内质网-线粒体相关膜在低氧诱导的平滑肌细胞增殖和内皮细胞损伤中的作用及机制研究
发布时间：2021-01-20 14:50
研究背景:低氧性肺动脉高压表现为持久的肺血管收缩及显著的肺血管重构,引起肺动脉压力明显增加,最终导致致命性的右心衰竭。以血管平滑肌细胞增殖及内皮细胞损伤为核心的细胞增殖/凋亡失衡是血管重构的关键因素。持续的低氧暴露可促进平滑肌细胞增殖,促进血管重构。血管内的平滑肌细胞同时也受其他细胞调控,内皮细胞位于血管壁的内层,调节平滑肌细胞增殖、血小板黏附和聚集、内源性舒张物质分泌等。低氧可诱导内皮细胞凋亡,激活NF-κB途经介导的黏附分子及促炎细胞因子表达,招募炎性细胞浸润。同时,舒张血管物质生成减少,收缩性物质分泌增多,进一步加重血管重构。线粒体不仅作为能量工厂,更是细胞内各种信号汇集传导的中转站,广泛参与细胞自噬,炎症应答,增殖/凋亡等生物进程。低氧时内皮细胞与平滑肌细胞均存在线粒体结构和功能的异常改变。低氧可促进平滑肌细胞糖酵解,抑制线粒体的有氧氧化。线粒体钙水平降低是抑制线粒体有氧氧化的主要因素之一,包括丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、酮戊二酸脱氢酶和ATP合酶等线粒体呼吸相关酶的活性依赖Ca2+的参与。因此,线粒体钙的减少可抑制氧化呼吸,并伴随线粒体氧自由基的失衡。...
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Control组和ER-mitochondrialinker组序列示意图
2.2.10 内质网-线粒体连接子组及对照组线粒体呼吸检测取 4000 个细胞接种于 Seahorse 检测 96 孔板内，待细胞贴壁后转染内质网-线粒体连接子和对照质粒，次日换液，置于 21%O2继续培养 48 h。测定耗氧率（oxygenconsumption rate，OCR）前日，加入 400 μL 水化液至各孔内，置于 37°C 无 CO2培养箱内孵育过夜。次日，配制 XF-96 检测培养基：加入 500 μL 谷氨酰胺（100×），500 μL丙酮酸钠溶液，200 μL 45% D-(+)葡萄糖溶液并添加 XF-96 基础培养基至终体积为 50mL，用 KOH 调节 PH 值至 7.4。用 XF-96 检测培养基稀释寡霉素（Oligo），线粒体氧化磷酸化解偶联剂（FCCP），鱼藤酮/抗霉素 A（Rot/AA）至终浓度为 2.4 μM，0.3 μM，0.6 μM。用 XF-96 检测培养基洗涤细胞 2 次后，加入 175 μL XF-96 检测培养基至各孔内，置于 37°C 无 CO2培养箱内孵育 1 h。依次加入各 25 μL 的 Oligo，FCCP，Rot/AA至药物板内，上机吸取药物后加入细胞板，测定 OCR。基础呼吸，最大呼吸及储备能力计算如图 2-2 所示。为了比较不同的实验批次，实验组的 OCR 值以对照组的相对值计算并比较。
N48、N72 组为 21%O2培养 48h、72h，H48 组为 4%O2培养 48h，R24 组为 4%O2培养 48h 后，于 21%O2培养 24h。A：增殖相关蛋白 PCNA 的表达变化。n=4。B：凋亡相关蛋白 cleaved caspase-3的表达改变。n=3。C：Edu（绿色）标记增殖的细胞核，Hoechst（蓝色）标记细胞核。n≧34 pictures/组。图像标尺=50 μm。低氧组与复氧组、对照组相比，*P <0.05; **P <0.01。2.3.2 低氧减少平滑肌细胞 MAMs 的形成通过检测全细胞匀浆及粗提线粒体（Crude mitochondria，Mc）中 MAMs 组成蛋白IP3Rs，FACL-4，VDAC1 等表达变化，探讨低氧时 MAMs 形成的改变[29]。如图 2-4A、B，WB 结果表明低氧时 MAMs 组成蛋白表达降低。随后，我们通过透射电镜观察内质网与线粒体，测定内质网与线粒体之间的最短距离以反映内质网膜与线粒体膜的接触。低氧暴露后，内质网膜与线粒体外膜之间的最短距离增加（图 2-4 C、D）。复氧后，MAMs 相关组成蛋白表达增加，最短距离减小。上述结果表明，低氧可诱导增殖的平滑肌细胞 MAMs 形成减少，复氧后增加。
本文编号：2989244
【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市
【文章页数】：163 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
Control组和ER-mitochondrialinker组序列示意图
2.2.10 内质网-线粒体连接子组及对照组线粒体呼吸检测取 4000 个细胞接种于 Seahorse 检测 96 孔板内，待细胞贴壁后转染内质网-线粒体连接子和对照质粒，次日换液，置于 21%O2继续培养 48 h。测定耗氧率（oxygenconsumption rate，OCR）前日，加入 400 μL 水化液至各孔内，置于 37°C 无 CO2培养箱内孵育过夜。次日，配制 XF-96 检测培养基：加入 500 μL 谷氨酰胺（100×），500 μL丙酮酸钠溶液，200 μL 45% D-(+)葡萄糖溶液并添加 XF-96 基础培养基至终体积为 50mL，用 KOH 调节 PH 值至 7.4。用 XF-96 检测培养基稀释寡霉素（Oligo），线粒体氧化磷酸化解偶联剂（FCCP），鱼藤酮/抗霉素 A（Rot/AA）至终浓度为 2.4 μM，0.3 μM，0.6 μM。用 XF-96 检测培养基洗涤细胞 2 次后，加入 175 μL XF-96 检测培养基至各孔内，置于 37°C 无 CO2培养箱内孵育 1 h。依次加入各 25 μL 的 Oligo，FCCP，Rot/AA至药物板内，上机吸取药物后加入细胞板，测定 OCR。基础呼吸，最大呼吸及储备能力计算如图 2-2 所示。为了比较不同的实验批次，实验组的 OCR 值以对照组的相对值计算并比较。
N48、N72 组为 21%O2培养 48h、72h，H48 组为 4%O2培养 48h，R24 组为 4%O2培养 48h 后，于 21%O2培养 24h。A：增殖相关蛋白 PCNA 的表达变化。n=4。B：凋亡相关蛋白 cleaved caspase-3的表达改变。n=3。C：Edu（绿色）标记增殖的细胞核，Hoechst（蓝色）标记细胞核。n≧34 pictures/组。图像标尺=50 μm。低氧组与复氧组、对照组相比，*P <0.05; **P <0.01。2.3.2 低氧减少平滑肌细胞 MAMs 的形成通过检测全细胞匀浆及粗提线粒体（Crude mitochondria，Mc）中 MAMs 组成蛋白IP3Rs，FACL-4，VDAC1 等表达变化，探讨低氧时 MAMs 形成的改变[29]。如图 2-4A、B，WB 结果表明低氧时 MAMs 组成蛋白表达降低。随后，我们通过透射电镜观察内质网与线粒体，测定内质网与线粒体之间的最短距离以反映内质网膜与线粒体膜的接触。低氧暴露后，内质网膜与线粒体外膜之间的最短距离增加（图 2-4 C、D）。复氧后，MAMs 相关组成蛋白表达增加，最短距离减小。上述结果表明，低氧可诱导增殖的平滑肌细胞 MAMs 形成减少，复氧后增加。
本文编号：2989244
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