铁自噬促Sideroflexin1依赖性线粒体铁超载介导apelin-13诱导心肌细胞肥大

发布时间：2017-04-14 10:14

  本文关键词：铁自噬促Sideroflexin1依赖性线粒体铁超载介导apelin-13诱导心肌细胞肥大，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:Apelin是G蛋白偶联受体APJ的内源性配体,在心血管系统形成及相关疾病的发生发展中具有重要作用。本实验室前期研究结果发现,apelin-13具有诱导心肌细胞肥大的作用,且自噬途径参与了apelin-13诱导的心肌细胞肥大过程。铁自噬(Ferritinophagy)是最新发现的一种调节细胞内铁代谢的选择性自噬。过度激活铁自噬可能诱导细胞内铁超载从而参与心肌肥厚的发展。本课题拟研究apelin-13对铁自噬及线粒体铁代谢的影响,并在前期研究的基础上探讨铁自噬-线粒体铁离子转运蛋白Sideroflexin1(SFXN1)依赖性线粒体铁超载介导apelin-13促心肌细胞肥大的新机制,揭示apelin-13/APJ系统诱导心肌肥厚的新的作用机制,为开发以APJ为靶点的抗心肌肥厚药物提供新的实验依据。方法:1、Western Blot:检测大鼠H9c2心肌细胞NCOA4,FTH1,SFXN1,TRC40,Tom7,Tom70,DMT1,BNP,LC3II/I的表达;2、分离线粒体并应用WB检测线粒体蛋白的表达;3、RNA干扰:设计RNA干扰链分别干扰H9c2心肌细胞中NCOA4,TRC40,Tom7,SFXN1的表达;4、普鲁士蓝染色法(Prussian blue staining)观察H9c2心肌细胞及心肌组织中铁沉积;5、钙黄绿素(calcein am)荧光探针检测h9c2心肌细胞中游离铁的变化;6、流式细胞术检测h9c2心肌细胞中线粒体螯合铁的含量;7、rpa荧光探针观察h9c2心肌细胞中线粒体螯合铁的含量;8、mito-sox荧光探针检测h9c2细胞中线粒体ros的生成;9、免疫荧光观察ncoa4和lc3b共定位;10、sceptertm手持细胞计数器测量h9c2心肌细胞的直径和体积;11、bca试剂盒测定h9c2心肌细胞中的蛋白含量;12、免疫组化观察人尸检心肌肥厚心脏组织标本和双肾双夹大鼠肾血管性高血压模型大鼠心脏组织中apelin,bnp,ncoa4,sfxn1蛋白的表达;结果:1、apelin-13增加h9c2心肌细胞内游离铁含量,且进一步促进铁负载剂-枸橼酸铁(fac)诱导的游离铁的增加;apelin-13诱导h9c2心肌细胞内铁沉积,且进一步促进铁剂fac诱导的铁沉积;2、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)及时间(0-24h)依赖性抑制h9c2细胞中铁自噬底物铁蛋白(fth1)的表达,促进铁自噬货物受体ncoa4的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断apelin-13(0.1μmol/l,24h)对fth1和ncoa4的作用;apelin-13促进ncoa4与gfp-lc3b融合;自噬体降解抑制剂羟基氯喹(hcq)阻断了apelin-13对fth1的降解作用,进一步促进了apelin-13对ncoa4的表达;apelin-13进一步增强铁负载剂-枸橼酸铁(fac)诱导的铁自噬;3、ncoa4-sirna抑制apelin-13(0.1μmol/l,48h)诱导的h9c2心肌细胞内游离铁的增加;4、apelin-13(0.1μmol/l,48h)促进线粒体铁超载;apelin-13(0.1μmol/l,6h)促进线粒体ros增加;透射电子显微镜下观察到apelin-13(0.1μmol/l,12h)引起h9c2心肌细胞线粒体肿胀及空泡化;5、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)和时间(0-24h)依赖性促进h9c2心肌细胞中线粒体转铁蛋白sfxn1的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断了apelin-13(0.1μmol/l,24h)对sfxn1的作用;6、ncoa4-sirna抑制apelin-13诱导的sfxn1的表达;7、sfxn1-sirna抑制apelin-13诱导的线粒体铁超载以及线粒体ros的生成;8、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)以及时间(0-24h)依赖性促进h9c2心肌细胞中线粒体外膜转运酶tom7,tom70的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断了apelin-13(0.1μmol/l,24h)对tom7,tom70的诱导作用;apelin-13促进tom7锚定于线粒体;9、tom7-sirna抑制apelin-13诱导的sfxn1的表达;10、apelin-13以剂量(0-1μmol/l)和时间(0-24h)依赖性促进h9c2细胞中尾锚蛋白识别因子trc40的表达;apj拮抗剂f13a(1μmol/l,24h)阻断了apelin-13(0.1μmol/l,24h)对trc40的作用;11、trc40-sirna抑制apelin-13诱导的tom7,sfxn1的表达;12、apelin-13促进铁离子转运体-二价金属离子转运体(dmt1)的表达,且被apj拮抗剂f13a抑制;13、Apelin-13促进H9c2心肌细胞直径、体积增大和细胞内蛋白含量增加;apelin-13促进心肌肥大因子BNP的表达,且被F13A抑制;14、NCOA4-siRNA抑制apelin-13诱导的H9c2心肌细胞直径、体积增大以及心肌肥大因子BNP表达;SFXN1-siRNA抑制apelin-13诱导H9c2心肌细胞直径、体积增大以及心肌肥大因子BNP表达;Tom7-siRNA,TRC40-siRNA抑制apelin-13诱导的H9c2心肌细胞内心肌肥大因子BNP的表达;15、人尸检心肌肥厚心脏标本中BNP,apelin,NCOA4,SFXN1高表达;且出现铁沉积;16、双肾双夹肾血管性高血压模型大鼠心脏组织中BNP,apelin,NCOA4,SFXN1高表达;出现铁沉积。结论:铁自噬促Sideroflexin1(SFXN1)依赖性线粒体铁超载介导apelin-13诱导心肌细胞肥大
【关键词】：Apelin-13 APJ 铁自噬 NCOA4 SFXN1 Tom7 TRC40 线粒体铁超载 线粒体ROS 心肌细胞肥大
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-13
• 主要英文缩略语索引13-17
• 第1章 绪论17-21
• 第2章 实验材料21-25
• 2.1 实验细胞21
• 2.2 实验组织21
• 2.3 主要试剂21-23
• 2.4 主要仪器23-25
• 第3章 实验方法25-31
• 3.1 H9c2细胞培养25
• 3.2 Western blot（蛋白免疫印迹）25
• 3.3 普鲁士蓝染色（核固红法）25-26
• 3.4 线粒体ROS检测（MitoSOX?）26
• 3.5 线粒体螯合铁检测（RPA荧光探针）26
• 3.6 SiRNA干扰26-28
• 3.7 线粒体蛋白的提取28
• 3.8 H9c2大鼠心肌细胞肥大的检测28-29
• 3.9 统计学方法29-31
• 第4章 实验结果31-59
• 4.1 Apelin-13诱导H9c2心肌细胞铁超载31-32
• 4.2 Apelin-13诱导H9c2心肌细胞铁自噬的发生32-35
• 4.3 NCOA4-siRNA抑制apelin-13诱导的H9c2心肌细胞铁超载35
• 4.4 Apelin-13促进H9c2细胞线粒体铁超载及线粒体ROS生成35-38
• 4.5 Apelin-13促进H9c2细胞中线粒体铁离子转运蛋白SFXN1的表达38-39
• 4.6 NCOA4-siRNA抑制apelin-13诱导的线粒体铁离子转运蛋白SFXN1表达39-40
• 4.7 SFXN1-siRNA抑制apelin-13诱导的线粒体铁超载40-41
• 4.8 Apelin-13促进H9c2细胞中线粒体外膜转位酶Tom70，Tom7的表达41-43
• 4.9 Tom7-siRNA抑制apelin-13诱导的线粒体铁离子转运蛋白SFXN1的表达43-44
• 4.10 Apelin-13促进H9c2细胞中尾猫蛋白识别因子TRC40表达44-45
• 4.11 TRC40-siRNA抑制apelin-13促H9c2心肌细胞中线粒体转锚定蛋白Tom7及SFXN1的表达45-46
• 4.12 Apelin-13诱导H9c2心肌细胞二价铁离子转运体DMT1的表达46-47
• 4.13 Apelin-13激活APJ促H9c2心肌细胞肥大47-48
• 4.14 铁自噬-SFXN1介导apelin-13促心肌细胞肥大48-53
• 4.15 人尸检心肌肥厚心脏组织中心肌肥大因子BNP, apelin，铁自噬蛋白NCOA4以及线粒体铁离子转运蛋白SFXN1高表达，且表现出铁沉积53-55
• 4.16 双肾双夹肾血管性高血压大鼠模型引起心肌肥厚心脏组织中心肌肥大因子BNP, apelin，铁自噬相关蛋白NCOA4，以及线粒体铁离子转运蛋白SFXN1高表达，，且表现出铁沉积55-59
• 第5章 讨论59-63
• 第6章 结论63-64
• 参考文献64-72
• 文献翻译72-84
• 综述84-102
• 作者攻读学位期间的科研成果102-106
• 致谢106-107

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 潘伟男;李峰;毛小环;秦旭平;邓水秀;封芬;陈锋;李兰芳;廖端芳;陈临溪;;14-3-3参与apelin-13促进大鼠血管平滑肌细胞增殖ERK1/2信号途径研究(英文)[J];生物化学与生物物理进展;2011年12期

2 杨莉;陈临溪;;Apelin/APJ系统对多个系统功能的调控作用[J];国际病理科学与临床杂志;2011年01期

3 李兰芳;李峰;朱炳阳;廖端芳;陈临溪;;双肾双夹易卒中型肾血管性高血压大鼠重要靶器官ACE2表达研究[J];中国病理生理杂志;2007年05期

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本文编号：305780