hFIX双筛选定点整合系统的研究及两个整合相关蛋白的初步探索
发布时间：2021-11-08 01:25
血友病B（hemophilia B）是人凝血IX因子（human clotting factor Ⅸ, hFⅨ）缺乏所引起的一种出血性疾病。基因治疗是遗传型疾病根本的治疗方法。然而遗传病基因治疗的应用依然面临两难的局面。免疫原性风险[1-4]和遗传安全性[1-4]为其应用中首先需要解决的问题。在前期成功使用rep-RBE定点整合转基因方法通过小鼠尾静脉注射方法获得hFIX长时间表达的实验基础上,本研究构建一种含CMV启动子-RBE元件-TK1基因的筛选标记的人凝血因子IX表达框架的质粒pCMV-RBE-TK1-N2-EFlα-hFIXml。该质粒和rep表达质粒共转染哺乳动物细胞可用于构建定点整合于AAVS1位点表达人类凝血因子Ⅸ的稳定细胞。特点为：携带有RBE顺式元件可以介导rep蛋白依赖的AAVS1位点整合；Neo正筛选基因可以用G418筛选获得整合细胞；RBE元件位于TK1基因和启动子之间,可以用阿昔洛韦去除没有RBE参与的非定点整合细胞；最后获得定点整合于AAVS1位点稳定表达人凝血因子IX的细胞。使用该质粒制备稳定表达人类凝血因子IX的稳定细胞,一方面正负双重筛选可以防止细胞...
【文章来源】：复旦大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EL工SA鉴定hFIX基因定点整合系统修饰细胞系hFIX表达情况
Ｈ、?ＺＮＦ４０３基因３’ＵＴＲ焚光素酶报告基因载体构建??人ＺＮＦ４０３基因３’ＵＴＲ全长４５９ｂｐ，仅克隆４３３ｂｐ?（不包含ｐｏｌｙＡ序列），见??图２。将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中标准序列进行Ｂｌａｓｔ比对，结果显示与标准序??列一致。??图２人ＺＮＦ４０３基因３ＭＪＴＲ序列琼脂糖凝胶电泳结果??１：人?ＺＮＦ４０３?基因?３’ＵＴＲ?序列；Ｍ：?ＴａｋａｒａＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ??四、巧光素酶活性实验初步鉴定铅向作用ＺＮＦ４０３基因的ｍｉＲＮＡ??将阴性对照质粒ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃ?（ＮＣ）和预测得到的４个ｍｉＲＮＡｓｍｉｍｉｃ与??重组巧光素酶报告质粒ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ共同转染ＨＥＫ２Ｗ细胞４化后，??检测巧光素酶活性，Ｗ此来判断各ｍｉＲＮＡ对ＺＮＦ４０３的抑制功能。结果显示，??与对照ｍｉＲＮＡ－ＮＣ组相比，实验姐中ＺＮＦ４０３巧光素酶活性没有显著降低，变??化甚微，不存在统计学意义（图３）。说明４种ｍｉＲＮＡ——ｍｉ艮－２３，ｍｉ民－１９９，??ｍｉＲ－１３５?和?ｌｅｔ－７ｇ＊，不调控?ＺＮＦ４０３?表达。??然而，与?ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴ民野生型组比较，ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３??３，ＵＴＲ对应ｍｉＲＮＡ预祀点点突变组（与ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ?ＷＴ质粒共??转）ＺＮＦ４０３巧光素酶活性升高２．５－３倍
检测巧光素酶活性，Ｗ此来判断各ｍｉＲＮＡ对ＺＮＦ４０３的抑制功能。结果显示，??与对照ｍｉＲＮＡ－ＮＣ组相比，实验姐中ＺＮＦ４０３巧光素酶活性没有显著降低，变??化甚微，不存在统计学意义（图３）。说明４种ｍｉＲＮＡ——ｍｉ艮－２３，ｍｉ民－１９９，??ｍｉＲ－１３５?和?ｌｅｔ－７ｇ＊，不调控?ＺＮＦ４０３?表达。??然而，与?ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴ民野生型组比较，ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３??３，ＵＴＲ对应ｍｉＲＮＡ预祀点点突变组（与ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ?ＷＴ质粒共??转）ＺＮＦ４０３巧光素酶活性升高２．５－３倍，存在显著差异（ｐ＜０．０１），具有统计学??意义。由于野生型实验组与对照组间无显著差异，故野生型组数据无意义（图３）。??５９??
【参考文献】：
期刊论文
[1]血友病A的基因治疗[J]. 刘慕君,刘艳平,刘雄昊. 中国临床药理学与治疗学. 2010(08)
[2]中国血友病B生物基因治疗研究状况[J]. 陈金中,薛京伦. 科学通报. 2009(18)
[3]LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定[J]. 谢海龙,陈主初,李金花,曾龙武,谭桂煌. 生物化学与生物物理进展. 2009(05)
[4]Sp1和Egr-1对LCRG1基因启动子转录活性的调节研究[J]. 谢海龙,曾龙武,周晓军. 医学研究生学报. 2009(04)
[5]血友病诊断和治疗的专家共识[J]. 诊断学理论与实践. 2008(05)
[6]microRNA与肿瘤[J]. 周凡,庄诗美. 生命科学. 2008(02)
[7]血友病的诊断和治疗[J]. 袁凯锋,廖小梅. 现代临床医学. 2007(03)
[8]microRNA及其应用前景[J]. 郑玉姝,赵朴,赵宏坤. 生物技术通讯. 2007(01)
[9]转染LCRG1基因的喉癌细胞差异蛋白质分析[J]. 章晓鹏,肖志强,陈主初,李萃,李建玲,余艳辉,欧阳咏梅,冯雪萍,张鹏飞. 癌症. 2006(01)
[10]血友病基因治疗的研究进展[J]. 高立艳,徐开林,潘秀英. 国外医学.输血及血液学分册. 2005(05)
博士论文
[1]MicroRNA-23a在胶质瘤中的功能和作用机制研究[D]. 连世忠.山西医科大学 2013
[2]MicroRNA-23a通过线粒体凋亡途径调节结肠癌化疗敏感性的机制研究[D]. 商京丽.第二军医大学 2011
[3]microRNA在TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中作用及机制的研究[D]. 阮溦.中南大学 2010
硕士论文
[1]靶向作用喉癌候选抑瘤基因LCRG1的microRNAs的初步筛选研究[D]. 赵娟霞.南华大学 2013
[2]MicroRNA-23b、MicroRNA-200b在系统性红斑狼疮患者血浆中表达及临床意义研究[D]. 龚德玉.中南大学 2012
本文编号：3482724
【文章来源】：复旦大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：97 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
EL工SA鉴定hFIX基因定点整合系统修饰细胞系hFIX表达情况
Ｈ、?ＺＮＦ４０３基因３’ＵＴＲ焚光素酶报告基因载体构建??人ＺＮＦ４０３基因３’ＵＴＲ全长４５９ｂｐ，仅克隆４３３ｂｐ?（不包含ｐｏｌｙＡ序列），见??图２。将测序结果与ＧｅｎＢａｎｋ中标准序列进行Ｂｌａｓｔ比对，结果显示与标准序??列一致。??图２人ＺＮＦ４０３基因３ＭＪＴＲ序列琼脂糖凝胶电泳结果??１：人?ＺＮＦ４０３?基因?３’ＵＴＲ?序列；Ｍ：?ＴａｋａｒａＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ??四、巧光素酶活性实验初步鉴定铅向作用ＺＮＦ４０３基因的ｍｉＲＮＡ??将阴性对照质粒ｍｉＲＮＡｍｉｍｉｃ?（ＮＣ）和预测得到的４个ｍｉＲＮＡｓｍｉｍｉｃ与??重组巧光素酶报告质粒ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ共同转染ＨＥＫ２Ｗ细胞４化后，??检测巧光素酶活性，Ｗ此来判断各ｍｉＲＮＡ对ＺＮＦ４０３的抑制功能。结果显示，??与对照ｍｉＲＮＡ－ＮＣ组相比，实验姐中ＺＮＦ４０３巧光素酶活性没有显著降低，变??化甚微，不存在统计学意义（图３）。说明４种ｍｉＲＮＡ——ｍｉ艮－２３，ｍｉ民－１９９，??ｍｉＲ－１３５?和?ｌｅｔ－７ｇ＊，不调控?ＺＮＦ４０３?表达。??然而，与?ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴ民野生型组比较，ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３??３，ＵＴＲ对应ｍｉＲＮＡ预祀点点突变组（与ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ?ＷＴ质粒共??转）ＺＮＦ４０３巧光素酶活性升高２．５－３倍
检测巧光素酶活性，Ｗ此来判断各ｍｉＲＮＡ对ＺＮＦ４０３的抑制功能。结果显示，??与对照ｍｉＲＮＡ－ＮＣ组相比，实验姐中ＺＮＦ４０３巧光素酶活性没有显著降低，变??化甚微，不存在统计学意义（图３）。说明４种ｍｉＲＮＡ——ｍｉ艮－２３，ｍｉ民－１９９，??ｍｉＲ－１３５?和?ｌｅｔ－７ｇ＊，不调控?ＺＮＦ４０３?表达。??然而，与?ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴ民野生型组比较，ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３??３，ＵＴＲ对应ｍｉＲＮＡ预祀点点突变组（与ｐｈＥＷ－ｌｕｃ－ＺＮＦ４０３?３’ＵＴＲ?ＷＴ质粒共??转）ＺＮＦ４０３巧光素酶活性升高２．５－３倍，存在显著差异（ｐ＜０．０１），具有统计学??意义。由于野生型实验组与对照组间无显著差异，故野生型组数据无意义（图３）。??５９??
【参考文献】：
期刊论文
[1]血友病A的基因治疗[J]. 刘慕君,刘艳平,刘雄昊. 中国临床药理学与治疗学. 2010(08)
[2]中国血友病B生物基因治疗研究状况[J]. 陈金中,薛京伦. 科学通报. 2009(18)
[3]LCRG1基因启动子关键顺式调节元件的鉴定[J]. 谢海龙,陈主初,李金花,曾龙武,谭桂煌. 生物化学与生物物理进展. 2009(05)
[4]Sp1和Egr-1对LCRG1基因启动子转录活性的调节研究[J]. 谢海龙,曾龙武,周晓军. 医学研究生学报. 2009(04)
[5]血友病诊断和治疗的专家共识[J]. 诊断学理论与实践. 2008(05)
[6]microRNA与肿瘤[J]. 周凡,庄诗美. 生命科学. 2008(02)
[7]血友病的诊断和治疗[J]. 袁凯锋,廖小梅. 现代临床医学. 2007(03)
[8]microRNA及其应用前景[J]. 郑玉姝,赵朴,赵宏坤. 生物技术通讯. 2007(01)
[9]转染LCRG1基因的喉癌细胞差异蛋白质分析[J]. 章晓鹏,肖志强,陈主初,李萃,李建玲,余艳辉,欧阳咏梅,冯雪萍,张鹏飞. 癌症. 2006(01)
[10]血友病基因治疗的研究进展[J]. 高立艳,徐开林,潘秀英. 国外医学.输血及血液学分册. 2005(05)
博士论文
[1]MicroRNA-23a在胶质瘤中的功能和作用机制研究[D]. 连世忠.山西医科大学 2013
[2]MicroRNA-23a通过线粒体凋亡途径调节结肠癌化疗敏感性的机制研究[D]. 商京丽.第二军医大学 2011
[3]microRNA在TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中作用及机制的研究[D]. 阮溦.中南大学 2010
硕士论文
[1]靶向作用喉癌候选抑瘤基因LCRG1的microRNAs的初步筛选研究[D]. 赵娟霞.南华大学 2013
[2]MicroRNA-23b、MicroRNA-200b在系统性红斑狼疮患者血浆中表达及临床意义研究[D]. 龚德玉.中南大学 2012
本文编号：3482724
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