过表达Atg5通过上调细胞自噬水平抑制瓣膜间质细胞成骨样分化

发布时间：2021-11-23 12:05

　　本文的主要目的是探究过表达自噬相关蛋白Atg5对主动脉瓣膜间质细胞自噬水平以及成骨样分化能力的影响,为钙化性主动脉瓣膜疾病的研究提供新方法和新思路。从猪主动脉瓣上分离原代瓣膜间质细胞,细胞免疫荧光进行表型鉴定后,采用成骨培养基诱导瓣膜间质细胞成骨分化,并用Western blot检测细胞Runx2、OPN表达分析细胞成骨分化能力,WB检测p62和LC3B-Ⅰ/Ⅱ的表达分析胞内自噬水平;构建过表达ATG5的重组质粒pAdTrack-ATG5并通过脂质体转染瓣膜间质细胞,采用Q-PCR、Western blot以及免疫荧光染色检测转染pAdTrack-ATG5后细胞Atg5的表达水平和细胞自噬水平的变化情况;对成骨诱导培养的主动脉瓣膜间质细胞分别转染空载质粒和过表达Atg5质粒,利用Western blot检测72 h后瓣膜间质细胞早期成骨指标Runx2、OPN的表达,并利用碱性磷酸酶染色和茜素红S染色方法检测Atg5对瓣膜间质细胞在诱导环境下的早晚期成骨样分化能力。结果显示,原代分离培养的瓣膜间质细胞的间质细胞标志物α-SMA和Vimentin的染色结果呈阳性,内皮细胞标志物vWF的染色... 

【文章来源】：重庆医科大学重庆市

【文章页数】：38 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

猪主动脉瓣膜间质细胞的表型鉴定Fig.1Phenotypicidentificationofporcineaorticvalveinterstitialcells

重庆医科大学硕士研究生学位论文12水平在第1天高于正常培养基培养的VICs(CM组)(P<0.01，OPN和p62的蛋白表达水平在第3天高于CM组(P<0.05)，Ⅱ型LC3B与I型LC3B的比值在第1天和第3天均低于CM组(P<0.001)(图2A和图2B)。同时，通过向pVICs转导表达LC3B-GFP融合蛋白的腺病毒后，在激光共聚焦显微镜可见，成骨培养基培养的pVICs自噬小体数量相较于对照组明显减少（图2C）。以上结果提示成骨分化的瓣膜间质细胞自噬水平呈下降趋势。图2自噬水平在瓣膜钙化模型中的检测Fig.2Detectionofautophagiclevelinvalveinterstitialcells

重庆医科大学硕士研究生学位论文17图3质粒pAdTrack-ATG5的构建及鉴定Fig.3ConstructionandidentificationoftheplasmidpAdTrack-ATG52.2过表达ATG5上调VICs自噬水平Q-PCR结果(图4A)显示,转染4μg和8μg重组质粒pAdTrack-ATG524h后，瓣膜间质细胞ATG5的mRNA表达水平显著高于NC组(P<0.001,P<0.001)，转染4μg重组质粒后VICs的mRNA水平高于8μg组(P<0.001)。Westernblot结果(图4B和图4C)显示，在转染48h后，过表达Atg5组中Atg5的蛋白表达水平显著高于NC组(P<0.001)，Ⅱ型LC3B与Ⅰ型LC3B的比值与NC组相比显著增加(P<0.05)，p62的蛋白表达则显著低于NC组(P<0.05)。免疫荧光结果(图4D)也表明，过表

【参考文献】：
期刊论文
[1]Etiology of bicuspid aortic valve disease: Focus on hemodynamics[J]. Samantha K Atkins,Philippe Sucosky.  World Journal of Cardiology. 2014(12)
[2]TGF-β1通过RUNX2调控人肝星状细胞系LX-2中骨桥蛋白表达[J]. 王睿,萧笑,王红红,赵丽娜,徐立,刘志国.  现代生物医学进展. 2013(35)



本文编号：3513846