间充质干细胞外泌体对血管损伤后新生内膜形成的影响与机制研究
发布时间:2021-11-24 11:53
研究背景与目的:血管内再狭窄是经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)术后,血管内皮创伤而再次发生管腔狭窄、阻塞的病理过程。尽管随着药物支架和药物球囊的出现使再狭窄发生率从最初的10%-30%降低至目前的5%左右,大大改善了冠心病患者预后,使冠心病的治疗发生里程碑式改变,但再狭窄的防治始终未获得突破性进展,特别是在糖尿病和复杂病变如弥漫病变、小血管、分叉病变等尤为突出,再狭窄率可达20%以上,并且药物洗脱支架或球囊并不能用于治疗所有的新生内膜斑块的形成。因此,解决血管内再狭窄成为刻不容缓的重大课题。间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)是一种多能干细胞,他们可以从大量的结缔组织中获得,如:骨髓,脂肪、脐带血等,具有自我更新的特性,可分化为多种类型的细胞,如成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞、平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMC)等。MSC多能分化及易于扩大培养的特性使得其治疗研究倍受关注。作为细胞之间传递功能物质的桥梁,外泌体在细胞间相互作用的微环境中受到越来越广泛的重视。外泌体作...
【文章来源】:西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】:91 页
【学位级别】:硕士
【部分图文】:
MSC表面标志物鉴定
西南大学硕士学位论文16⑤以300×g离心力离心5min,去除上清,每组各加200μLPBS,随后分别加入1μLCD29、1μLCD90、1μLCD11b和三者各1μL并轻轻混匀(空白组不作处理);⑥室温条件下避光孵育15-20min,以300×g离心力离心5min去除上清,加600μL/管PBS,缓慢混匀,上机检测;⑦检测前用空白组调节电压,单染组调节补偿,随后检测三染组。3.4实验结果3.4.1MSC形态特征培养至2-7代的MSC用于后续实验,第一代(passage1,P1)和第三代(passage3,P3)细胞形态如图3.1所示,P1的MSC形态具有触角等针状形状出现,P3的MSC呈现出梭形、纺锤状不规则形态。图3.1MSC形态特征3.4.2流式细胞术鉴定流式细胞术分析提取的MSC表面标志物CD29、CD90和CD11b的表达情况,如图3.2所示。以空白组细胞为阴性对照,鉴定细胞CD29的阳性率为99.6%,CD90的阳性率为99.8%,CD11b的阳性率为0.17%。图3.2MSC表面标志物鉴定3.5讨论
西南大学硕士学位论文24②加2mL胎牛血清以中止过度染色,将标记的外泌体以110000×g离心力超速离心1h以去除残余染料,随后将外泌体沉淀重悬于200μLPBS中,于4℃冰箱避光保存,可用于后续的摄取实验;③用共聚焦培养皿培养EC,将标记后的外泌体(20μg/mL的作用浓度)添加到EC中,37℃细胞培养箱避光孵育8h;④小心去除细胞培养液,用PBS洗涤1-2次;⑤每个样品中加入1mL4%多聚甲醛固定液,避光孵育10min;⑥吸去固定液,用PBS洗涤1-2次,每次2min,水平摇床轻微振荡;⑦每个样品中加入500μL1×Hoechst33342染液,避光孵育5min;⑧吸去1×Hoechst33342染液,用PBS洗涤三次,每次2min,水平摇床轻微振荡;⑨最后在共聚焦皿中加入1mLPBS(以免细胞完全干燥),避光保存,共聚焦显微镜观察对照组及实验组的荧光显色情况。4.4实验结果4.4.1MSC-Exo透射电子显微镜分析结果通过TEM,我们在不同的倍数下观察提取的MSC-Exo的形状,如图4.1所示,黑色箭头所指即外泌体,从图中可知MSC-Exo呈不规则椭圆形、类似盘状,并且大小不一。图4.1MSC-Exo形态特征4.4.2MSC-Exo粒径分析结果
【参考文献】:
期刊论文
[1]Stem cell-derived exosomes as a therapeutic tool for cardiovascular disease[J]. Etsu Suzuki,Daishi Fujita,Masao Takahashi,Shigeyoshi Oba,Hiroaki Nishimatsu. World Journal of Stem Cells. 2016(09)
本文编号:3515922
【文章来源】:西南大学重庆市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】:91 页
【学位级别】:硕士
【部分图文】:
MSC表面标志物鉴定
西南大学硕士学位论文16⑤以300×g离心力离心5min,去除上清,每组各加200μLPBS,随后分别加入1μLCD29、1μLCD90、1μLCD11b和三者各1μL并轻轻混匀(空白组不作处理);⑥室温条件下避光孵育15-20min,以300×g离心力离心5min去除上清,加600μL/管PBS,缓慢混匀,上机检测;⑦检测前用空白组调节电压,单染组调节补偿,随后检测三染组。3.4实验结果3.4.1MSC形态特征培养至2-7代的MSC用于后续实验,第一代(passage1,P1)和第三代(passage3,P3)细胞形态如图3.1所示,P1的MSC形态具有触角等针状形状出现,P3的MSC呈现出梭形、纺锤状不规则形态。图3.1MSC形态特征3.4.2流式细胞术鉴定流式细胞术分析提取的MSC表面标志物CD29、CD90和CD11b的表达情况,如图3.2所示。以空白组细胞为阴性对照,鉴定细胞CD29的阳性率为99.6%,CD90的阳性率为99.8%,CD11b的阳性率为0.17%。图3.2MSC表面标志物鉴定3.5讨论
西南大学硕士学位论文24②加2mL胎牛血清以中止过度染色,将标记的外泌体以110000×g离心力超速离心1h以去除残余染料,随后将外泌体沉淀重悬于200μLPBS中,于4℃冰箱避光保存,可用于后续的摄取实验;③用共聚焦培养皿培养EC,将标记后的外泌体(20μg/mL的作用浓度)添加到EC中,37℃细胞培养箱避光孵育8h;④小心去除细胞培养液,用PBS洗涤1-2次;⑤每个样品中加入1mL4%多聚甲醛固定液,避光孵育10min;⑥吸去固定液,用PBS洗涤1-2次,每次2min,水平摇床轻微振荡;⑦每个样品中加入500μL1×Hoechst33342染液,避光孵育5min;⑧吸去1×Hoechst33342染液,用PBS洗涤三次,每次2min,水平摇床轻微振荡;⑨最后在共聚焦皿中加入1mLPBS(以免细胞完全干燥),避光保存,共聚焦显微镜观察对照组及实验组的荧光显色情况。4.4实验结果4.4.1MSC-Exo透射电子显微镜分析结果通过TEM,我们在不同的倍数下观察提取的MSC-Exo的形状,如图4.1所示,黑色箭头所指即外泌体,从图中可知MSC-Exo呈不规则椭圆形、类似盘状,并且大小不一。图4.1MSC-Exo形态特征4.4.2MSC-Exo粒径分析结果
【参考文献】:
期刊论文
[1]Stem cell-derived exosomes as a therapeutic tool for cardiovascular disease[J]. Etsu Suzuki,Daishi Fujita,Masao Takahashi,Shigeyoshi Oba,Hiroaki Nishimatsu. World Journal of Stem Cells. 2016(09)
本文编号:3515922
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