泛素化修饰调控低氧性肺动脉高压的作用靶点及机制研究
发布时间：2023-11-07 19:32
肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是严重危害人类健康易致死亡的心肺血管疾病,如果未及时诊断和积极治疗,患者早期中位生存期不超过3年。PAH主要特征为肺血管功能和结构发生进行性改变,可导致右心衰竭而死亡。低氧是诱发和加重PAH的常见致病因素之一,它能够导致肺血管内环境紊乱,发生严重的血管功能与结构的改变。在肺动脉血管重构过程中,PASMC(pulmonary artery smooth muscle cell,PASMC)的表型转换、增殖、迁移和凋亡失衡是PAH发生发展的重要环节。作为典型的PAH保护性信号通路,BMP-Smadl/5-PPARγ的激活可以对抗PAH致病信号通路TGF-β-Smad3,发挥重要的血管保护作用。同时越来越多的研究证明血管保护因子的泛素化和去泛素化调控在PAH中也发挥着重要的作用。我们近来研究,腺苷酸激活蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)磷酸化血管紧张素转化酶2(Angiotensin-converting enzyme 2,ACE2)能够有效地抑制其泛素化降解而发挥...
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
前言
第1章 MDM2调控ACE2泛素化参与PAH的病理过程
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物、细胞
1.1.2 实验设备
1.1.3 主要实验试剂与抗体
1.1.4 实验试剂配制
1.2 实验方法
1.2.1 临床患者肺组织标本
1.2.2 HEK293细胞培养和siRNA转染
1.2.3 免疫共沉淀(CO-IP)
1.2.4 实验动物分组
1.2.5 小鼠血流动力学检测步骤
1.2.6 右心室肥厚指标评估
1.2.7 肺组织与右心室取材与存放
1.2.8 苏木素-伊红染色步骤
1.2.9 肺组织蛋白提取步骤
1.2.10 肺组织蛋白定量步骤
1.2.11 Western Blot步骤
1.2.12 Angiogram步骤
1.2.13 统计方法
1.3 实验结果
1.3.1 UbiBrowser预测PPARγ和ACE2的E3泛素连接酶及BMPRII突变的家族性PAH大数据分析
1.3.2 临床患者和实验性小鼠PAH肺组织标本中MDM2和ACE2蛋白表达水平检测及MDM2对ACE2稳定性调控
1.3.3 E3泛素连接酶MDM2调控ACE2在低氧下的泛素化降解
1.3.4 MDM2抑制剂JNJ-165改善小鼠PAH及血管重构病理改变
1.4 讨论
第2章 BRCC36对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的作用及机制
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物、细胞、重组腺病毒
2.1.2 实验设备
2.1.3 主要实验试剂与抗体
2.1.4 实验试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 实验动物分组及流程示意图
2.2.2 PAH缺氧模型建立
2.2.3 小鼠基因组DNA提取
2.2.4 SMA22α-BRCC36过表达转基因小鼠的鉴定
2.2.5 小鼠血流动力学检测步骤
2.2.6 右心室肥厚指标评估
2.2.7 肺组织与右心室取材与存放
2.2.8 肺组织石蜡切片制作步骤
2.2.9 苏木素-伊红染色步骤
2.2.10 Weigert弹力纤维染色步骤
2.2.11 免疫组织化学染色步骤
2.2.12 TUNEL细胞凋亡检测步骤(显色法)
2.2.13 肺组织蛋白提取步骤
2.2.14 肺组织蛋白定量步骤
2.2.15 Western Blot步骤
2.2.16 临床患者肺组织标本
2.2.17 临床人肺动脉平滑肌细胞获取与培养
2.2.18 大鼠PASMC原代培养
2.2.19 PASMC传代步骤
2.2.20 PASMC鉴定
2.2.21 CCK-8法检测PASMC的增殖活力实验
2.2.22 TUNEL细胞凋亡检测(荧光法)
2.2.23 Transwell迁移小室检测细胞迁移实验步骤
2.2.24 293A细胞复苏、传代、冻存步骤
2.2.25 重组腺病毒扩增及收集
2.2.26 细胞蛋白提取步骤
2.2.27 细胞蛋白定量步骤
2.2.28 细胞总RNA提取步骤
2.2.29 cDNA反转录合成步骤
2.2.30 RT-PCR步骤
2.2.31 统计方法
2.3 实验结果
2.3.1 缺氧对C57BL/6野生型小鼠右心室压力和肺动脉病理性重构的影响
2.3.2 缺氧处理对野生小鼠肺组织中BRCC36等细胞因子表达水平的影响
2.3.3 临床PAH患者肺组织标本及离体培养的PASMC中BRCC36细胞因子表达水平检测
2.3.4 SMA22α-BRCC36特异性过表达小鼠鉴定结果
2.3.5 平滑肌细胞特异性过表达BRCC36对慢性缺氧小鼠PAH及肺动脉病理性重构的影响
2.3.6 过表达BRCC36对BMP/TGF-β-PPARγ信号通路的影响
2.3.7 大鼠PASMC原代培养及鉴定
2.3.8 探讨缺氧干预对PASMC内BMP-Smad1/5及PPARγ的调节效应及对BRCC表达的影响
2.3.9 探讨BMP-PPARγ-apoE通路的活化对BRCC36表达的调节效应
2.3.10 BRCC36重组腺病毒感染PASMC效果
2.3.11 探讨BRCC36对PASMC缺氧条件下BMP-PPA:Rγ-apoE轴的调节效应
2.3.12 探讨BRCC36对PASMC缺氧条件下TGF-β-Smad3-PPARγ信号通路的影响
2.4 讨论
第3章 PAE对PAH及肺血管重构的疗效及对BRCC36表达水平的影响
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物的来源
3.1.2 实验设备
3.1.3 主要实验试剂与抗体
3.1.4 实验试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 PAE溶液配制
3.2.2 实验动物分组
3.2.3 PAH缺氧模型建立
3.2.4 右心室测压检测步骤
3.2.5 右心室肥厚指标评估
3.2.6 肺组织与右心室取材与存放
3.2.7 肺组织右心室石蜡切片制作步骤
3.2.8 苏木素-伊红染色步骤
3.2.9 弹力纤维染色步骤
3.2.10 免疫组织化学染色步骤
3.2.11 TUNEL细胞凋亡检测步骤
3.2.12 肺组织蛋白提取步骤
3.2.13 肺组织蛋白定量步骤
3.2.14 Western Blot操作步骤
3.2.15 统计方法
3.3 实验结果
3.3.1 PAE可改善慢性缺氧所诱导的右心室压力增加和右心室肥厚
3.3.2 PAE可改善慢性缺氧诱导的肺血管重构
3.3.3 PAE可改善慢性缺氧诱导肺血管肌化、增殖和凋亡的影响
3.3.4 PAE对低氧诱导的BMP-PPARγ-id1信号通路下调的影响
3.3.5 PAE可抑制慢性缺氧诱导的TGF-β1-Smad3的激活
3.3.6 PAE可诱导去泛素化酶BRCC36在肺组织中的表达
3.4 讨论
结语
参考文献
附录
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
本文编号：3861298
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
符号说明
前言
第1章 MDM2调控ACE2泛素化参与PAH的病理过程
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物、细胞
1.1.2 实验设备
1.1.3 主要实验试剂与抗体
1.1.4 实验试剂配制
1.2 实验方法
1.2.1 临床患者肺组织标本
1.2.2 HEK293细胞培养和siRNA转染
1.2.3 免疫共沉淀(CO-IP)
1.2.4 实验动物分组
1.2.5 小鼠血流动力学检测步骤
1.2.6 右心室肥厚指标评估
1.2.7 肺组织与右心室取材与存放
1.2.8 苏木素-伊红染色步骤
1.2.9 肺组织蛋白提取步骤
1.2.10 肺组织蛋白定量步骤
1.2.11 Western Blot步骤
1.2.12 Angiogram步骤
1.2.13 统计方法
1.3 实验结果
1.3.1 UbiBrowser预测PPARγ和ACE2的E3泛素连接酶及BMPRII突变的家族性PAH大数据分析
1.3.2 临床患者和实验性小鼠PAH肺组织标本中MDM2和ACE2蛋白表达水平检测及MDM2对ACE2稳定性调控
1.3.3 E3泛素连接酶MDM2调控ACE2在低氧下的泛素化降解
1.3.4 MDM2抑制剂JNJ-165改善小鼠PAH及血管重构病理改变
1.4 讨论
第2章 BRCC36对慢性缺氧诱导的PAH及肺血管重构的作用及机制
2.1 实验材料
2.1.1 实验动物、细胞、重组腺病毒
2.1.2 实验设备
2.1.3 主要实验试剂与抗体
2.1.4 实验试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 实验动物分组及流程示意图
2.2.2 PAH缺氧模型建立
2.2.3 小鼠基因组DNA提取
2.2.4 SMA22α-BRCC36过表达转基因小鼠的鉴定
2.2.5 小鼠血流动力学检测步骤
2.2.6 右心室肥厚指标评估
2.2.7 肺组织与右心室取材与存放
2.2.8 肺组织石蜡切片制作步骤
2.2.9 苏木素-伊红染色步骤
2.2.10 Weigert弹力纤维染色步骤
2.2.11 免疫组织化学染色步骤
2.2.12 TUNEL细胞凋亡检测步骤(显色法)
2.2.13 肺组织蛋白提取步骤
2.2.14 肺组织蛋白定量步骤
2.2.15 Western Blot步骤
2.2.16 临床患者肺组织标本
2.2.17 临床人肺动脉平滑肌细胞获取与培养
2.2.18 大鼠PASMC原代培养
2.2.19 PASMC传代步骤
2.2.20 PASMC鉴定
2.2.21 CCK-8法检测PASMC的增殖活力实验
2.2.22 TUNEL细胞凋亡检测(荧光法)
2.2.23 Transwell迁移小室检测细胞迁移实验步骤
2.2.24 293A细胞复苏、传代、冻存步骤
2.2.25 重组腺病毒扩增及收集
2.2.26 细胞蛋白提取步骤
2.2.27 细胞蛋白定量步骤
2.2.28 细胞总RNA提取步骤
2.2.29 cDNA反转录合成步骤
2.2.30 RT-PCR步骤
2.2.31 统计方法
2.3 实验结果
2.3.1 缺氧对C57BL/6野生型小鼠右心室压力和肺动脉病理性重构的影响
2.3.2 缺氧处理对野生小鼠肺组织中BRCC36等细胞因子表达水平的影响
2.3.3 临床PAH患者肺组织标本及离体培养的PASMC中BRCC36细胞因子表达水平检测
2.3.4 SMA22α-BRCC36特异性过表达小鼠鉴定结果
2.3.5 平滑肌细胞特异性过表达BRCC36对慢性缺氧小鼠PAH及肺动脉病理性重构的影响
2.3.6 过表达BRCC36对BMP/TGF-β-PPARγ信号通路的影响
2.3.7 大鼠PASMC原代培养及鉴定
2.3.8 探讨缺氧干预对PASMC内BMP-Smad1/5及PPARγ的调节效应及对BRCC表达的影响
2.3.9 探讨BMP-PPARγ-apoE通路的活化对BRCC36表达的调节效应
2.3.10 BRCC36重组腺病毒感染PASMC效果
2.3.11 探讨BRCC36对PASMC缺氧条件下BMP-PPA:Rγ-apoE轴的调节效应
2.3.12 探讨BRCC36对PASMC缺氧条件下TGF-β-Smad3-PPARγ信号通路的影响
2.4 讨论
第3章 PAE对PAH及肺血管重构的疗效及对BRCC36表达水平的影响
3.1 实验材料
3.1.1 实验动物的来源
3.1.2 实验设备
3.1.3 主要实验试剂与抗体
3.1.4 实验试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 PAE溶液配制
3.2.2 实验动物分组
3.2.3 PAH缺氧模型建立
3.2.4 右心室测压检测步骤
3.2.5 右心室肥厚指标评估
3.2.6 肺组织与右心室取材与存放
3.2.7 肺组织右心室石蜡切片制作步骤
3.2.8 苏木素-伊红染色步骤
3.2.9 弹力纤维染色步骤
3.2.10 免疫组织化学染色步骤
3.2.11 TUNEL细胞凋亡检测步骤
3.2.12 肺组织蛋白提取步骤
3.2.13 肺组织蛋白定量步骤
3.2.14 Western Blot操作步骤
3.2.15 统计方法
3.3 实验结果
3.3.1 PAE可改善慢性缺氧所诱导的右心室压力增加和右心室肥厚
3.3.2 PAE可改善慢性缺氧诱导的肺血管重构
3.3.3 PAE可改善慢性缺氧诱导肺血管肌化、增殖和凋亡的影响
3.3.4 PAE对低氧诱导的BMP-PPARγ-id1信号通路下调的影响
3.3.5 PAE可抑制慢性缺氧诱导的TGF-β1-Smad3的激活
3.3.6 PAE可诱导去泛素化酶BRCC36在肺组织中的表达
3.4 讨论
结语
参考文献
附录
参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
本文编号：3861298
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/xxg/3861298.html
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