氧化应激损伤中NFKB1多态性对NF-κB信号通路及细胞凋亡的分子机制研究

发布时间：2017-05-24 10:17

  本文关键词：氧化应激损伤中NFKB1多态性对NF-κB信号通路及细胞凋亡的分子机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:以H2O2诱导人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)建立体外氧化应激损伤模型,观测核因子κB 1基因-94号位点ATTG插入/缺失(-94ins/del ATTG,rs28362491)对NF-κB信号通路及细胞凋亡的影响。方法:1)分离并培养原代HUVECs,细胞纯度鉴定采用免疫荧光法检测vWF抗体表达及流式细胞仪检测CD31抗体表达;2)采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)法将HUVEC分为插入型(II型)、缺失型(DD型)以及杂合子型(ID型);3)Western blot法及免疫荧光标记法检测NFKB1不同基因型HUVECs中P50蛋白的表达水平;4)CCK-8法检测不同浓度及不同诱导时间H2O2对HUVECs活力的影响,选取最适宜的H2O2诱导浓度及时间,建立体外氧化应激损伤模型;5)以H2O2诱导HUVECs激活NF-κB信号通路,Western blot法及免疫荧光标记法检测NFKB1不同基因型HUVECs细胞核内P50、P65蛋白表达水平;6)以H2O2诱导HUVECs细胞凋亡,Western blot法及流式细胞仪检测NFKB1不同基因型细胞凋亡情况。结果:1)实验共收集细胞63株,免疫荧光法检测vWF抗体表达量为98±0.12%,流式细胞仪检测CD31抗体表达量为93.3%;2)PCR-RFLP分型结果显示:所收集的63株HUVECs中,NFKB1插入型(II型)13株,缺失性(DD型)13株,杂合子型(ID型)37株;3)Western blot及免疫荧光结果显示:DD型P50蛋白表达水平较II型显著降低;4)CCK-8结果显示:200 umol/L H2O2诱导HUVECs 12 h即可明显降低细胞活力;5)Western blot及免疫荧光结果显示:200 umol/L H2O2诱导HUVECs 12 h可激活NF-κB信号通路,且DD型HUVECs细胞核中P50、P65蛋白表达水平显著低于II型;6)Western blot及流式细胞学检测结果显示:200 umol/L H2O2诱导HUVECs12 h可诱导细胞发生凋亡,且DD型凋亡水平较II型显著增高。结论:1)原代脐静脉内皮细胞分离培养可以获得高纯度的HUVECs,且具有简单、实用、有效、易操作等特点;2)NFKB1基因多态性可影响NF-κB信号通路中P50蛋白的表达水平;3)H2O2可抑制HUVECs活力,建立体外氧化应激损伤模型;4)H2O2诱导HUVECs可激活细胞内NF-κB信号通路,NFKB1基因多态性可影响NF-κB信号通路的活化水平;5)H2O2诱导HUVECs激活NF-κB信号通路可促使细胞发生凋亡,NFKB1不同基因型中细胞凋亡水平具有显著差异。
【关键词】：NFKB1 NF-κB信号通路 H2O2 人原代脐静脉内皮细胞 动脉粥样硬化
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 摘要9-11
• ABSTRACT11-13
• 前言13-16
• 材料与方法16-31
• 1. 实验材料16-20
• 1.1 主要仪器设备16-17
• 1.2 主要试剂及材料17-19
• 1.3 标本制备及主要试剂配制19-20
• 2. 实验方法20-30
• 2.1 原代脐静脉内皮细胞分离培养20-22
• 2.2 组织DNA提取及基因分型22-24
• 2.3 NFKB1基因多态性对HUVECs内P50蛋白表达的影响24-27
• 2.4 氧化应激对HUVECs毒性活力的影响27-28
• 2.5 NFKB1基因多态性及氧化应激对NF-κB信号通路的影响28-29
• 2.6 NFKB1基因多态性及氧化应激对HUVECs凋亡的影响29
• 2.7 统计学方法29-30
• 3. 技术路线图30-31
• 结果31-41
• 讨论41-49
• 小结49-50
• 致谢50-51
• 参考文献51-59
• 综述59-65
• 参考文献62-65
• 攻读硕士学位期间发表的学位论文65

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