高迁移率族蛋白1对抗中性粒细胞抗体诱导中性粒细胞细胞外罗网形成作用的研究

发布时间：2017-06-15 17:01

  本文关键词：高迁移率族蛋白1对抗中性粒细胞抗体诱导中性粒细胞细胞外罗网形成作用的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的在体外探讨高迁移率族蛋白1(High mobility group box 1, HMGB1)是否可以通过促进抗中性粒细胞胞浆抗体(Antineutrophil cytoplasmic antiboy, ANCA)诱导中性粒细胞细胞外罗网(Neutmphil extracellular traps, NETs)形成,从而参与ANCA相关性小血管炎(ANCA associated vasculitis, AAV)的发病过程。方法通过密度梯度离心法提取健康献血员外周血中性粒细胞。在体外,用HMGB1及活动期AAV患者血浆置换液中提取的VNCA-1gG共同刺激中性粒细胞,细胞免疫荧光染色观察NETs的形成,并计算形成的百分比。Pico-green dsDNA/NE Ts染色通过荧光强度检测dsDNA/NETs浓度进行NETs的定量。结果细胞免疫荧光染色可以观察到HMGB1与ANCA共同刺激组有典型NETs的形成,与空白对照、单独HMGB1或ANC A刺激组相比,HMGB1与ANCA共同刺激NETs形成的百分比明显增加(P0.05)。同样的dsDNA/NETs染色荧光强度NETs定量分析发现,IMGB1与MPO-ANCA共同刺激组中性粒细胞dsDNA/NETs的浓度,分别与空白对照、单加HMGB1或MPO-ANCA、健康1gG+HMGB1组相比明显增加(286.60±29.58ng/ml vs.513.97±116.29 ng/ml, P0.001; 340.82±60.63 ng/ml vs. 513.97±116.29ng/ml, P0.001; 396.63±112.64 ng/ml vs.513.97±116.29 ng/ml, P=0.001,359.82±76.86 ng/ml vs.513.97±116.29 ng/ml, P=0.002)。HMGB1与PR3-ANCA共同刺激组中性粒细胞dsDNA/NETs的浓度,分别与空白对照、单加HMGB1或PR31-ANCA、健康1gG+HMGB1组相比明显增加(273.20±11.76ng/ml vs.540.25±130.95 ng/ml, P0.001; 358.38±80.01ng/ml vs.540.25±130.95ng/ml, P0.001; 334.78±87.16 ng/ml vs.540.25±130.95 ng/ml, P0.001; 407.25±89.90 ng/ml vs.540.25±130.95 ng/ml, P=0.018)。单加HMGB1或ANCA、健康1gG+HMGB1分别与空白对照比较无明显差异(P0.05)。结论HMGB1促进ANCA诱导NETs形成,从而参与AAV的发病过程。目的体外实验已证明HMGB1可以通过促进ANCA诱导NETs的形成,从而参与AAV的致病过程,本研究旨在探讨在该过程中HMGB1发挥效应所依赖的受体情况以及是否需要NADPH氧化酶。方法通过密度梯度离心法提取健康献血员外周血中性粒细胞。在体外,分别加入Toll样受体(Toll like receptor, TLR) 2、TLR4及晚期糖基化终末产物受体(Receptor for advanced glycation end products, RAGE)抑制剂或阻断剂以及NADPH氧化酶抑制剂DPI预处理中性粒细胞后,分别给予HMGB1及活动期AAV患者血浆置换液中提取的ANCA-1gG刺激,Pico-green dsDNA/NE Ts染色荧光强度及细胞免疫荧光染色进行NETs的定量分析。结果dsDNA/NETs染色荧光强度NETs定量分析提示,HMGB1与MPO-ANCA共同孵育组中性粒细胞dsDNA/NETs的浓度为537.25±90.11ng/ml,预先加入TLR2、TLR4及RAG E抑制剂或阻断剂处理组dsDNA/NETs的浓度与其比较明显降低,差异有统计学意义(537.25±90.11 ng/ml vs. 403.51±87.89 ng/ml, P=0.012; 537.25±90.11 ng/ml vs.386.18±97.14 ng/ml, P=0.003; 537.25±90.11 ng/ml vs.340.62±66.44 ng/ml, P0.001; 537.25±90.11 ng/ml vs.371.89±70.22 ng/ml, P=0.001)。HMGB1与PR3-ANCA共同孵育组中性粒细胞dsDNA/NETs的浓度为540.33±142.82 ng/ml,预先加入TLR2、 TLR4及RAGE抑制剂或阻断剂处理组dsDNA/NETs的浓度明显降低,差异有统计学意义(540.33±142.82 ng/ml vs.355.79±64.70 ng/ml, P=0.005, 540.33±142.82 ng/ml vs.367.42±73.51 ng/ml, P=0.009; 540.33±142.82 ng/ml vs.371.46±56.36ng/ml, P=0.008; 540.33±142.82 ng/ml vs.355.24±51.29 ng/ml,P=0.008)。细胞免疫荧光染色NETs形成百分比分析以及TLR2、TLR4基因敲除的小鼠骨髓中性粒细胞进一步验证以上实验结果。HMGB1与 PR3-ANCA或MPO-ANCA共同孵育组中性粒细胞dsDNA/NETs的浓度以及NETs形成百分比与预先加入DPI处理组比较,预先加入DPI处理组明显降低,差异有统计学意义(533.66±118.10 ng/ml vs.458.33±136.59 ng/ml, P=0.01; 577.93±121.69 ng/ml vs.450.93±07.549 ng/ml, P=0.001)。结论HMGB1促进ANCA诱导NETs形成过程,需要依赖与TLR2、TLR4及RAGE,并且该过程NETosis依赖NADPH氧化酶。
【关键词】：高迁移率族蛋白1 抗中性粒细胞胞浆抗体 中性粒细胞细胞外罗网 抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎 高迁移率族蛋白1 抗中性粒细胞胞浆抗体 中性粒细胞细胞外罗网 抗中性粒细胞胞浆抗体相关性血管炎
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543
【目录】：

• 个人简历3-5
• 中文摘要5-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-15
• 第一部分：高迁移率族蛋白1促进抗中性粒细胞诱导中性粒细胞细胞外罗网形成15-31
• 材料和方法15-23
• 实验结果23-28
• 讨论28-31
• 第二部分 高迁移率族蛋白1促进中性粒细胞细胞外罗网形成主要依赖受体情况31-48
• 材料和方法31-41
• 实验结果41-44
• 讨论44-48
• 结论48-49
• 参考文献49-55
• 综述55-82
• 参考文献67-82
• 附录82-84
• 致谢84-86
• 在读期间发表及待发表论文86
• 学术会议交流86

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本文编号：452940