SPIO与Fth1基因标记MSCs体外分化为心肌细胞的MRI研究

发布时间：2017-06-25 14:15

  本文关键词：SPIO与Fth1基因标记MSCs体外分化为心肌细胞的MRI研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的本研究旨在评价铁蛋白基因Fth1标记大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)的可行性、有效性及安全性。观察不同浓度的超顺磁性氧化铁(SPIO)及Fth1基因标记对MSCs增殖活性的影响。探讨SPIO及Fth1基因标记两种方法对MSCs定向分化心肌细胞分化能力的影响。体外研究SPIO及Fth1基因标记MSCs定向分化心肌细胞的MRI表现及其差异。方法1.采用全骨髓贴壁法分离、培养SD大鼠MSCs,流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34、CD44及CD90,成骨及成脂肪诱导分化进行鉴定。2.构建携带铁蛋白重链基因Fth1的慢病毒表达载体。Fth1报告基因慢病毒转染MSCs荧光显微镜观察增强型绿色荧光蛋白EGFP表达,q RT-PCR、Western blot检测Fth1基因及目的蛋白表达情况。3.将不同浓度(25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml)的超顺磁性氧化铁(SPIO)标记MSCs;普鲁士蓝染色检测SPIO标记效率;CCK-8法检测SPIO标记MSCs的增殖活性。4.用不同浓度柠檬酸铁培养液(0.1 mol/L、1 mol/L、3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L)培养Fth1-MSCs,普鲁士蓝染色检测细胞摄铁情况,CCK-8法检测Fth1-MSCs的增殖活性。5.将50μg/ml SPIO和Fth1标记的MSCs体外经10μmol/L 5-aza诱导向心肌细胞分化,诱导28天后病理染色检测心肌特异性标记物(α-肌动蛋白、心肌肌钙蛋白T)的表达情况。在标记后不同时间点,对两组MSCs定向分化的心肌细胞进行MRI检查,观察其信号变化情况及两组信号的差异性。结果1.全骨髓贴壁法提取的MSCs呈梭形、放射状排列并贴壁生长,CD34、CD44及CD90阳性细胞率分别为2.8%,99.8%,99.5%,具有向骨细胞及脂肪细胞定向分化的能力。2.通过酶切PCR鉴定及重组载体基因测序验证,成功构建携带铁蛋白重链Fth1及荧光蛋白基因的过表达慢病毒载体p CDH-EGFP-Fth1。3.Fth1基因成功转染MSCs,荧光显微镜下观察约80%MSCs表达EGFP,qRT-PCR及Western blot检测铁蛋白重链基因及其目的蛋白表达量较普通MSCs明显增加。4.与浓度25μg/ml、75μg/ml及100μg/ml的比较,浓度50μg/ml的SPIO对MSCs标记效率高,可达98%,且对MSCs增殖活性影响较小,与浓度25μg/ml组比较差异无统计学意义(P0.05),而浓度为75μg/ml及100μg/ml的SPIO虽然标记效率高,但对MSCs增殖活性有明显影响,与对照组、25μg/ml组及50μg/ml组比较差异有明显统计学意义(P0.05)。5.未加入柠檬酸铁培养液培养,Fth1-MSCs增殖活性与对照组差异无统计学意义(P0.05);加入Fe浓度为0.1 mol/L的含铁培养液后,普鲁士蓝染色未观察到蓝色颗粒;加入Fe浓度为1 mol/L、3 mol/L、5 mol/L、7 mol/L条件培养基的Fth1-MSCs细胞质内均有蓝色颗粒,并随条件培养基铁浓度增加而染色加深,但随着浓度的增加,细胞的形态受到一定影响,且细胞增殖活性与对照组相比差异均有统计学意义(P0.05)。6.50μg/ml SPIO及Fth1标记MSCs定向诱导分化后均能表达心肌细胞特异性标记物(α-肌动蛋白、心肌肌钙蛋白T)。随着SPIO浓度升高,MRI的T2信号逐渐降低;SPIO标记MSCs心肌细胞分化过程中随时间延长信号逐渐降低,至28天时MRI T2信号无降低,与标记前相同。Fth1-MSCs加入柠檬酸铁培养液5天后MRI上T2信号降低,且随时间延长信号无明显变化,28天时MRI T2信号与5天、14天相比差异均无统计学意义(P0.05)。结论1.可成功构建携带Fth1的慢病毒过表达载体,转染后的Fth1-MSCs能稳定、高效地表达Fth1,并不影响其增殖活性,但加入柠檬酸铁培养基后对细胞增殖有一定影响。2.50μg/ml浓度的SPIO可高效标记MSCs,MRI信号改变明显,且对细胞增殖活性影响相对较小,为标记MSCs的最适SPIO浓度。3.Fth1的慢病毒过表达载体转染MSCs在未加入柠檬酸铁培养液培养时,对Fth1-MSCs增殖活性没有影响,条件培养基铁浓度越高,细胞摄入铁也越多,但对细胞形态及增殖活性影响越大,因此选择1 mol/L的柠檬酸铁培养液较为适宜。4.50μg/ml浓度SPIO及Fth1报告基因标记,均不影响MSCs向心肌细胞分化的能力。MR可检测50μg/ml浓度SPIO及Fth1标记MSCs心肌细胞分化过程的信号变化,50μg/ml标记MSCs心肌细胞分化过程中低信号随时间延长逐渐升高,至标记后28天低信号基本消失,而心肌细胞分化中的Fth1-MSCs加入条件培养基后28天低信号没有明显改变,可进行长期示踪监测。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 超顺磁性氧化铁 铁蛋白报告基因 心肌细胞分化 MRI成像 生物学特性
【学位授予单位】：蚌埠医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54;R445.2
【目录】：

• 中文摘要5-8
• ABSTRACT8-11
• 引言11-13
• 主要仪器与设备13-14
• 主要实验试剂14-15
• 1.材料与方法15-26
• 2.结果26-39
• 3.讨论39-43
• 4.结论43-44
• 参考文献44-47
• 致谢47-48
• 附录A 主要试剂配制48-49
• 附录B 干细胞移植治疗急性心肌梗死 MRI 示踪的研究进展49-56
• 参考文献54-56
• 附录C 硕士期间发表的学术论文56

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本文编号：482445