HFHG5基因的功能研究

发布时间：2017-06-25 13:03

  本文关键词：HFHG5基因的功能研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：据世界卫生组织最新统计,心脏病以12.9%致死率位居疾病的首位。该疾病已成为科学家们急待解决的世界性难题。已知心脏病的早期症状可表现为病理性心肌肥大。因此,从分子学水平上系统地研究心肌肥大的调控机制,将为治愈心脏病提供理论指导。已有研究表明,在小鼠模型(主动脉捆扎法)及病人组织样本中HFHG5的表达均上调,这暗示了心肌肥厚的发生可能与HFHG5相关。本实验室通过荧光素报告系统分析及CO-IP实验发现,HFHG5与Smad3/4存在相互作用,这暗示了HFHG5很可能通过TGF-β/Smads信号途径进行调控心肌肥大的发生,但其机制尚未被研究。接下来的研究就此展开。为了研究HFHG5基因调控心肌肥大发生的机制,本文开展了下述研究:(1)构建了重组腺病毒载体pAd-HFHG5并制备了腺病毒,经验证腺病毒Ad HFHG5构建成功。Ad HFHG5主要用于新生大鼠原代心肌细胞中过表达HFHG5的实验。同时,成功构建了干扰载体pSuper-HFHG5-shRNA及验证了实验室已有的过表达载体p CMV-Myc-h-HFHG5,这一对载体主要用于体外干扰和过表达HFHG5的细胞实验。(2)利用PE及FBS分别刺激新生大鼠原代心肌细胞(AdGFP组及AdHFHG5组),检测到HFHG5表达在肥大刺激后均会发生上调,这表明HFHG5与心肌肥大相关。(3)通过免疫荧光实验研究HFHG5与Smad4的定位情况,发现HFHG5在细胞质和细胞核中均有表达,且在细胞质中与Smad4存在共定位。(4)Western blot实验发现,过表达HFHG5促进了Smad4入核,而干扰HFHG5会抑制Smad4入核,这证明了HFHG5通过促进Smad4的入核,参与TGF-β/Smads信号途径的调控。(5)初步研究了HFHG5与Smad4协同入核后的下游调控机制。RT-PCR实验证明HFHG5与Smad4协同入核后可以激活下游肥大相关基因的表达,表明HFHG5促进心肌肥大发生的分子机制主要是HFHG5与Smad4协同入核调控下游肥大基因的转录。总之,以上实验表明HFHG5与Smad4相互作用,通过TGF-β/Smads信号途径调控心肌肥大的发生。这些结果为针对心肌肥大疾病的治疗策略提供了新的线索。
【关键词】：HFHG5 Smad4 心肌肥大 TGF-β/Smads信号途径 腺病毒载体
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-13
• 1 引文和文献综述13-20
• 1.1 心脏发育过程13-14
• 1.2 模式动物—小鼠14
• 1.3 TGF-β/Smads信号途径及其与心肌肥大的关系14-18
• 1.3.1 TGF-β 超家族14-15
• 1.3.2 Smads蛋白家族15-17
• 1.3.3 TGF-β 信号转导的Smads通路17
• 1.3.4 TGF-β/Smads信号通路与心肌肥大的关系17-18
• 1.4 本文研究意义18-20
• 2 材料与方法20-45
• 2.1 材料20-26
• 2.1.1 所用生物信息学工具20-21
• 2.1.2 主要试剂和仪器21-22
• 2.1.3 质粒22-26
• 2.1.3.1 腺病毒包装质粒22-23
• 2.1.3.2 表达型质粒23-25
• 2.1.3.3 克隆型质粒25-26
• 2.2 腺病毒构建方法26-37
• 2.2.1 主要试剂配制26
• 2.2.2 重组质粒pMD18-T-HFHG5的构建26-30
• 2.2.2.1 总RNA的抽提26-27
• 2.2.2.2 反转录RT-PCR27
• 2.2.2.3 PCR产物的纯化回收27-28
• 2.2.2.4 连接T载体28
• 2.2.2.5 感受态细胞DH5a的制备28-29
• 2.2.2.6 转化及扩培（热休克法）29
• 2.2.2.7 质粒的制备29-30
• 2.2.2.8 质粒酶切30
• 2.2.3 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的构建30-32
• 2.2.3.1 穿梭质粒pAdTrack-CMV的线性化31
• 2.2.3.2 目的片段与线性化pAdTrack-CMV载体连接、转化及扩培31
• 2.2.3.3 重组质粒的酶切鉴定31
• 2.2.3.4 重组质粒的测序31-32
• 2.2.4 重组腺病毒载体Ad-HFHG5的构建32-35
• 2.2.4.1 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的单酶切线性化32
• 2.2.4.2 电转化感受态细菌的制备32-33
• 2.2.4.3 线性化的pAdTrack-HFHG5穿梭载体转化33
• 2.2.4.4 重组腺病毒载体pAd-HFHG5筛选33-34
• 2.2.4.5 提取无内毒素质粒34
• 2.2.4.6 重组腺病毒载体pAd-HFHG5单酶切及鉴定34-35
• 2.2.5 腺病毒的制备35-37
• 2.2.5.1 准备 293A细胞35
• 2.2.5.2 转染实验35
• 2.2.5.3 收集病毒35-36
• 2.2.5.4 扩增病毒36-37
• 2.3 新生大鼠原代心肌细胞的分离与培养37
• 2.4 重组质粒pSuper-HFHG5-shRNA构建方法37-40
• 2.4.1 设计HFHG5 shRNA模板寡核苷酸37-39
• 2.4.2 正反义链的退火反应39
• 2.4.3 pSuper质粒的双酶切线性化39-40
• 2.4.4 退火目的片段与线性化pSuper的连接、转化及扩培40
• 2.4.5 重组质粒的酶切鉴定40
• 2.4.6 shRNA干扰效率的验证40
• 2.5 免疫荧光实验40-42
• 2.6 提取核质蛋白及Western blot实验42-45
• 2.6.1 细胞核/质蛋白的提取42
• 2.6.2 Western blot实验42-45
• 3 实验结果及其分析45-55
• 3.1 腺病毒Ad-HFHG5的制备45-47
• 3.1.1 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的构建及鉴定45
• 3.1.2 穿梭质粒pAdTrack-HFHG5的测序鉴定45-46
• 3.1.3 重组腺病毒载体pAd-HFHG5的酶切鉴定46-47
• 3.1.4 线性化重组腺病毒载体pAd-HFHG5转染HEK293A细胞47
• 3.2 重组质粒pSuper-HFHG5-shRNA构建47-50
• 3.2.1 退火反应合成目的片段47-48
• 3.2.2 重组质粒pSuper-HFHG5-shRNA的酶切鉴定48-49
• 3.2.3 验证pSuper-HFHG5-shRNA对HFHG5表达的干扰效率49-50
• 3.3 重组质粒pCMV-Myc-h-HFHG5的鉴定50
• 3.4 PE及FBS刺激原代心肌细胞，HFHG5的表达会发生上调50-52
• 3.5 HFHG5与Smad4在亚细胞中有共定位52
• 3.6 HFHG5通过促进Smad4入核，从而促进了心肌肥大52-55
• 3.6.1 过表达HFHG5促进Smad4的入核52-53
• 3.6.2 促进心肌肥大的机制的初步研究53-55
• 4 讨论55-58
• 5 其他工作58-62
• 5.1 构建多种类型载体58-59
• 5.2 体外合成HFHG5的特异性探针和非特异性探针59
• 5.3 注射ISO和生理盐水，，诱导Lrrc10、pygo1小鼠心脏肥厚59-60
• 5.4 荧光报告系统实验60
• 5.5 多种基因型小鼠的繁殖及鉴定60-62
• 结语62-64
• 参考文献64-70
• 附录70-73
• 致谢73-74

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