RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞Ca_v1.2、Ca_v1.3基因表达的影响

发布时间：2017-07-13 11:00

  本文关键词：RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞Ca_v1.2、Ca_v1.3基因表达的影响

  更多相关文章： RNA干扰 大鼠 血管平滑肌细胞 Ca_v1.2 Ca_v1.3 MTT

【摘要】：血管平滑肌细胞主要存在于血管中模内,它是构成血管中膜的物质基础,发挥着一定的生理功能,对调节血管壁的舒张性及维持血管壁的完整性有着重要的作用。近年来研究发现,随着大气污染加剧,心血管病频频出现。其病理学分子机制是近年来血管增殖性疾病研究及防治热点、难点。因此掌握一种高效、简单的血管平滑肌细胞培养方法是很有必要的。RNA干扰是近几年来新发展的一种基因阻断技术,是一种可以使mRNA发生特异性降解的转录后基因沉默现象。它已成为抗肿瘤、抗病毒、调控基因表达、基因治疗、研究基因功能等领域的一个重要研究方向及热点。研究表明,L-Ca2+α1亚基在血管平滑肌细胞中起着很重要的作用。大鼠主动脉平滑肌上L-Ca2+ αl亚基主要受Cav1.2和Cav1.3编码影响。本课题采用组织块贴壁法培养原代大鼠血管平滑肌细胞,然后传至5-8代,用构建的靶向Cav1.2、Cav1.3基因siRNA载体转染大鼠血管平滑肌细胞,特异性沉默大鼠胸主动脉平滑肌细胞Cav1.2、Cav1.3基因的表达。用MTT法检测siRNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞活性的影响。再用荧光实时定量RT-PCR和Western-Blot等分子生物学技术检测Cav1.2、Cav1.3 mRNA平及其蛋白质表达水平,从生物大分子水平证明RNA干扰对这两种基因的抑制效应。结果显示,转染24 h后,即出现转染阳性细胞,48 h后,观察发现荧光强度进一步增强。经计算得出转染效率大于70%。转染72 h后,收集细胞,提取mRNA进行PCR测定后,结果可见阴性对照组与空白对照组相比较,Cav1.2、Cav1.3　mRNA表达水平差异无显著性意义(P0.05),实验组的Cav1.2与Cav1.3 mRNA表达水平显著低于空白对照组,分别比空白组下降86.54%、88.38%(P0.01)。转染72h后,收集细胞,提取蛋白进行Western-Blot检测后,观察条带可见,空白对照组与阴性对照组的Cav1.2、Cav1.3蛋白杂交带亮度明显强于基因组,分析结果可见阴性对照组与空白对照组相比较,Cav1.2、Cav1.3蛋白表达水平差异无显著性意义(P0.05),实验组的Cav1.2与Cav1.3蛋白表达量比空白组分别下降80.36%、82.69%(P0.05)。结果表明转染siRNA的表达载体可明显抑制大鼠血管平滑肌细胞Cav1.2、Cav1.3基因在转录和翻译水平上的表达,基因组Cav1.2、Cav1.3的RNA的表达和蛋白表达较阴性对照组和空白对照组明显受到抑制。此方法可为探索血管致病基因及发病机制等提供重要的科学依据及参考。
【关键词】：RNA干扰 大鼠 血管平滑肌细胞 Ca_v1.2 Ca_v1.3 MTT
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：X51;R54
【目录】：

• 中文摘要8-10
• Abstract10-12
• 第一章 文献综述12-22
• 1.1 血管平滑肌细胞的研究进展及培养12-15
• 1.2 RNA干扰15-19
• 1.3 选题背景、研究内容及意义19-22
• 1.3.1 选题背景19
• 1.3.2 研究内容19-20
• 1.3.3 研究课题意义20-22
• 第二章 大鼠血管平滑肌细胞的培养22-26
• 2.1 前言22
• 2.2 材料与方法22
• 2.2.1 试验用材22
• 2.2.2 主要试剂22
• 2.3 方法22-24
• 2.3.1 大鼠血管平滑肌细胞培养22-23
• 2.3.2 细胞传代23-24
• 2.4 讨论24-26
• 第三章 RNA干扰大鼠血管平滑肌细胞Ca_v1.2、Ca_v1.3基因26-32
• 3.1 引言26
• 3.2 材料26
• 3.2.1 试验用材26
• 3.2.2 主要试剂26
• 3.3 方法26-29
• 3.3.1 shRNA的合成26-27
• 3.3.2 MTT法测定转染后大鼠血管平滑肌细胞的存活率27-28
• 3.3.3 shRNA转染细胞28-29
• 3.4 结果29-30
• 3.5 讨论30-32
• 第四章 RT-PCR法及Western-Blot检测Ca_v1.2、Ca_v1.3mRNA和蛋白的表达32-38
• 4.1 材料与试剂32
• 4.2 方法32-34
• 4.2.1 细胞RNA提取及含量测定32
• 4.2.2 cDNA合成32-33
• 4.2.3 荧光实时定量PCR33
• 4.2.4 总蛋白提取33
• 4.2.5 Western-Blot检测蛋白的表达33-34
• 4.2.6 统计处理34
• 4.3 结果34-36
• 4.3.1 RNA干扰后对血管平滑肌细胞Ca_v1.2、Ca_v1.3 mRNA表达的影响34-35
• 4.3.2 血管平滑肌细胞Ca_v1.2、Ca_v1.3蛋白表达的变化35-36
• 4.4 讨论36-38
• 第五章 结论38-39
• 参考文献39-45
• 攻读学位期间取得的研究成果45-46
• 致谢46-47
• 个人简况及联系方式47-48
• 承诺书48-49

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 李悦梅,冯大明,万载阳,王双,沈丹彤,赵桂玲,杨永宗;组织块法培养大鼠肠系膜小动脉的平滑肌细胞[J];南华大学学报(医学版);2003年03期

2 王敏,崔连群,王晓军,烟玉琴,韩秋霞,秦风菊;动脉血管平滑肌细胞、血管内皮细胞原代培养方法的改良及应用[J];山东医药;2004年14期

3 戴敏;李后开;;丹皮酚对动脉粥样硬化家兔血管平滑肌细胞增殖的影响[J];中国药理学通报;2006年05期

，

本文编号：536621