整合素β3胞浆段尾部NITY基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响及机制研究

发布时间：2017-07-16 02:00

  本文关键词：整合素β3胞浆段尾部NITY基序对αⅡbβ3介导的细胞功能的影响及机制研究

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【摘要】：整合素αIIbβ3(GPⅡb-Ⅲa)是血小板膜上的主要受体,通过双向信号转导介导血小板的黏附、伸展和聚集。整合素αIIbβ3信号转导过程中,β3胞浆段的氨基酸起关键性作用,许多信号分子(如talin,kindlin等)与β3胞浆段特定的氨基酸序列相互作用,调控整合素αIIbβ3的双向信号转导。整合素β3胞浆段尾部NITY基序调控整合素αIIbβ3相关信号转导及机制研究至今尚未完全阐明。本研究体外细胞模型:利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞建立共表达人类野生型整合素αIIb和野生型β3或突变型β3?NITY(β3胞浆段缺失NITY基序)稳转细胞株,通过细胞在固相化纤维蛋白原上的黏附伸展实验检测各稳转细胞株的的黏附及伸展功能,通过免疫共沉淀方法检测蛋白相互作用。体内小鼠模型:利用逆转录病毒感染的造血干细胞移植建立空载(vector)、β3野生型和β3?NITY转基因小鼠模型,在血小板上研究整合素β3胞浆段尾部NITY基序对血小板功能的调控作用。通过转基因血小板与游离的纤维蛋白原的结合检测整合素αIIbβ3的内向外信号转导功能;通过转基因血小板在固相化纤维蛋白原的伸展检测整合素αIIbβ3的外向内信号转导功能。体外实验结果表明,成功建立了CHO-αIIbβ3和CHO-αIIbβ3?NITY细胞株。稳定表达野生型整合素αIIbβ3的CHO细胞获得在固相化纤维蛋白原上的黏附和伸展能力,相较于CHO-αIIbβ3细胞株,CHO-αIIbβ3?NITY细胞株黏附能力减弱,但是黏附后的伸展能力无明显改变。免疫共沉淀结果显示,kindlin-2能够结合野生型整合素β3,但与突变型整合素β3结合的量显著减少。而src与野生型整合素β3和突变型整合素β3的结合无明显差异。小鼠实验结果表明,成功构建了vector、β3野生型和β3胞浆段缺失NITY基序的转基因小鼠模型。相较于β3野生型的血小板,β3?NITY的血小板与游离纤维蛋白原的结合能力减弱,但是在固相化纤维蛋白原上的伸展能力不受影响。结论:整合素β3胞浆段缺失NITY基序导致整合素αIIbβ3介导的内向外信号转导受到部分损伤,但不影响整合素αIIbβ3介导的外向内信号转导。这种缺失突变导致整合素β3与kindlin蛋白的结合受到抑制,从而部分抑制了整合素αIIbβ3介导的内向外信号转导。
【关键词】：整合素αIIbβ3 稳转细胞株 kindlin-2蛋白 造血干细胞移植 逆转录病毒 双向信号转导
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-10
• 符号说明10-13
• 前言13-22
• 实验材料与方法22-38
• 1. 实验材料22-23
• 1.1 质粒和细胞株22
• 1.2 主要试剂22-23
• 1.3 主要耗材23
• 1.4 实验动物23
• 2. 实验方法23-38
• 2.1 构建稳转细胞株23-26
• 2.1.1 构建编码突变型人整合素 β3 的真核表达载体23
• 2.1.2 细胞转染与稳转细胞株的建立23-24
• 2.1.3 流式细胞术检测稳转细胞株中 β3 和 αIIb的表达24
• 2.1.4 蛋白印迹法（Western blot）检测稳转细胞株中整合素 αIIb和 β3 蛋白的表达24-26
• 2.2 细胞在固相化纤维蛋白原上的黏附及伸展试验26
• 2.3 蛋白免疫共沉淀（Co-IP）检测稳转细胞株胞内的蛋白质相互作用26-28
• 2.3.1 Co-IP检测 β3 与kindlin蛋白之间的相互作用27
• 2.3.2 Co-IP检测 β3 与src之间的相互作用27-28
• 2.4 纯合子小鼠繁殖与鉴定28-30
• 2.4.1 纯合子小鼠繁殖28
• 2.4.2 纯合子小鼠的基因型鉴定28-30
• 2.5 逆转录病毒的获得30-33
• 2.5.1 病毒质粒的抽提及测序30-31
• 2.5.2 逆转录病毒包装及感染效率测定31-33
• 2.6 小鼠造血干细胞移植33-35
• 2.6.1 移植前准备33-34
• 2.6.2 骨髓移植34-35
• 2.7 流式细胞仪检测转基因小鼠血小板的 β3 及GFP的表达35
• 2.8 转基因血小板的功能分析35-37
• 2.8.1 流式细胞仪检测转基因小鼠血小板与游离纤维蛋白原的结合35-36
• 2.8.2 转基因小鼠血小板在固相化纤维蛋白原的伸展36-37
• 2.9 统计学分析37-38
• 实验结果38-54
• 1. 稳转细胞株的建立38-40
• 1.1 β3 突变型（β3?NITY）真核表达载体的构建38-39
• 1.2 流式细胞术检测稳转细胞株中 αIIb和 β3 的表达39
• 1.3 免疫印迹法检测蛋白的表达39-40
• 2. 细胞在固相化纤维蛋白原上的黏附及伸展情况40-42
• 3. Co-IP检测稳转细胞株胞内的蛋白质相互作用42-43
• 3.1 Co-IP检测 β3 与kindlin蛋白之间的相互作用42
• 3.2 Co-IP检测 β3 与src之间的相互作用42-43
• 4. 逆转录病毒感染的造血干细胞移植方法的评估43-45
• 5. 纯合子小鼠的基因型鉴定45
• 6. 空载、野生型及突变型整合素 β3 逆转录病毒的获得45-48
• 6.1 逆转录病毒载体的测序鉴定45-46
• 6.2 逆转录病毒包装46-47
• 6.3 逆转录病毒感染效率测定47-48
• 7. 转基因小鼠血小板的 β3 及GFP的表达48-50
• 8. 转基因小鼠血小板与游离纤维蛋白原的结合50-51
• 9. 转基因小鼠血小板在固相化纤维蛋白原上的伸展51-54
• 讨论54-59
• 结论59-60
• 参考文献60-63
• 致谢63-64
• 附录64

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本文编号：546594