心脏成纤维细胞中NLRP3炎症小体对新生乳鼠心肌细胞体外增殖能力的影响及机制研究

发布时间：2017-07-19 10:27

  本文关键词：心脏成纤维细胞中NLRP3炎症小体对新生乳鼠心肌细胞体外增殖能力的影响及机制研究

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【摘要】：心肌病、冠心病、风湿性心脏病等心脏疾病的主要病理特征为功能性心肌细胞数量缺失。对于心脏再生增殖和心肌损伤修复的研究、哺乳动物心肌细胞的体外培养方法和再生增殖特征的研究,以及炎性条件下心肌中炎症小体的产生,尤其是NLRP3炎症小体对心肌细胞增殖修复的影响为当前关注的热点。本研究采用新生C57 BL/6乳鼠心脏细胞和心脏成纤维细胞体外原代共培养方法,研究不同日龄乳鼠心肌细胞的体外增殖特征,并通过构建体外炎症模型观察NLRP3炎症小体对心肌细胞体外增殖的影响。该课题研究在进化、发展和再生生物学领域具有深远的意义,同时对婴幼儿心脏疾病以及由炎症引起的青少年心肌炎患者的治疗具有重要的指导作用。一、新生乳鼠心脏细胞体外共培养体系的建立及其在心肌细胞体外增殖研究中的应用目的:建立新生C57 BL/6乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞体外原代培养和共培养体系,研究不同日龄的新生C57 BL/6乳鼠心肌细胞的体外增殖特征。方法:(1)采用混合酶消化法(0.08%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型胶原酶组成的混合酶消化液)消化不同日龄(出生1,3,5,7,9天)提取的新生C57 BL/6乳鼠心脏细胞,通过差速贴壁法和化学抑制剂法分离和纯化心肌细胞,台盼蓝检测细胞存活率。(2)分别对心肌细胞和成纤维细胞进行体外原代培养和上述二种细胞的共培养。(3)用倒置相差显微镜观察细胞的生长情况和形态变化;分别用α-横纹肌肌动蛋白(α-sarcomeric actin,α-SA)抗体和波形蛋白(Vimentin)抗体对心肌细胞和成纤维细胞进行免疫细胞化学染色,以鉴定细胞的纯度。通过记录心肌细胞每分钟的搏动次数测定心肌细胞的细胞活力。(4)MTT法测定单独培养和共培养条件下心肌细胞的增殖活性。(5)检测各组细胞中细胞周期调控因子Cyclin D1和CDK4、心脏分化相关因子GATA4、Nkx2.5以及成纤维细胞生长因子FGF1的表达情况。结果:(1)混合消化酶提取的细胞数量多,存活率高;培养1 h后成纤维细胞先贴壁,12 h后心肌细胞几乎全部贴壁。(2)心肌细胞中α-横纹肌动蛋白表达呈阳性,纯度可达93%,成纤维细胞中波形蛋白表达呈阳性,纯度可达95%。(3)共培养24 h后,心肌细胞多以细胞团的形式贴壁生长,可见部分细胞团的自发搏动;单独培养24 h后,心肌细胞贴壁呈梭形;共培养的心肌细胞比单独培养的心肌细胞交联速度快,达到搏动同步的时间早。(4)出生5天以内的乳鼠心肌细胞数量和体积明显增大,共培养的心肌细胞的细胞活力更大、增殖速度快;出生5天以后的乳鼠心肌细胞数量变化并不明显。(5)出生5天以内的乳鼠心肌细胞中Cyclin D1和CDK4的表达量较高,且共培养的心肌细胞表达量要高于单独培养的心肌细胞表达量;GATA4、Nkx2.5和FGF1的表达随日龄增大而增加。结论:(1)差速贴壁法和化学抑制剂法能够有效地分离心肌细胞和成纤维细胞,得到纯度高、活力好的心肌细胞。(2)不同日龄的心肌细胞在共培养环境下生长状态良好。(3)出生5天内的心肌细胞体外培养时具有较强的增殖能力,且成纤维细胞能促进心肌细胞增殖;出生5天以后的乳鼠心肌细胞的增殖能力减弱甚至消失。(4)建立新生乳鼠心肌细胞和成纤维细胞体外原代培养和共培养方法可用于后续的研究观察。二、NLRP3炎症小体激活后对心肌细胞体外增殖的影响研究目的:研究成纤维细胞中的NLRP3炎症小体激活后对新生C57BL/6乳鼠心肌细胞体外增殖能力的影响。方法:(1)采用双酶消化法分别提取日龄为1天的野生型和Nlrp3-/-基因敲除C57BL/6小鼠乳鼠心脏细胞,通过差速贴壁法和化学抑制剂法分离和纯化心肌细胞和成纤维细胞。(2)将细胞按如下分组接种到细胞培养板:野生型成纤维细胞单独培养,野生型成纤维细胞与心肌细胞共培养,Nlrp3-/-成纤维细胞与野生型心肌细胞共培养,Nlrp3-/-心肌细胞单独培养。各组细胞在体外正常培养24h后,分别加入10ng/m L的LPS,作用24 h,再加入3 m M的ATP刺激1h,同时设立正常培养基培养的对照组。(3)用倒置相差显微镜观察各实验组细胞与对照组细胞的生长情况;MTT法测定细胞的增殖活性;收集培养板中各组细胞,用蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot方法检测炎症因子NLRP3、ASC、Caspase-1,细胞周期调控因子CDK4、Cyclin D1,心肌细胞增殖分化相关因子Nkx2.5、GATA4蛋白的表达情况;用real time PCR(荧光定量PCR)检测相应基因的m RNA表达水平;ELISA方法检测各组细胞培养液上清中的IL-1β含量;对结果进行统计分析。结果:(1)与对照组相比,经LPS/ATP刺激的实验中,单独培养的心肌细胞活性有所降低,数量略有减少。共培养的心肌细胞受到损伤且细胞数量明显减少;野生型心肌细胞受损程度大于Nlrp3-/-心肌细胞。(2)Western Blot检测结果显示:与对照组相比,实验组的NLRP3、ASC、Caspase-1表达显著增加、CDK4、Cyclin D1、Nkx2.5、GATA4表达降低;real time PCR检测结果与分子水平的变化一致;实验组上清中IL-1β的量与对照组相比明显升高。结论:(1)LPS/ATP炎症刺激后使心脏细胞尤其是成纤维细胞中的NLRP3炎症小体被激活。(2)激活的NLRP3炎症小体促进炎症因子的产生并诱导炎症反应的发生,从而可导致心肌细胞增殖分化能力减弱。
【关键词】：心肌细胞 成纤维细胞 增殖 NLRP3 共培养
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要6-9
• Abstract9-12
• 缩略词12-14
• 前言14-21
• 参考文献17-21
• 第一部分 新生乳鼠心脏细胞体外共培养方法的建立及其在心肌细胞体外增殖研究中的应用21-45
• 一、实验材料22-28
• 二、实验方法及操作步骤28-34
• 三、实验结果34-41
• 四、讨论41-42
• 五、小结42
• 参考文献42-45
• 第二部分 成纤维细胞中NLRP3炎症小体对心肌细胞增殖影响的初步机制研究45-61
• 一、实验材料45-47
• 二、实验方法及操作步骤47-53
• 三、实验结果53-58
• 四讨论58-59
• 五、小结59
• 参考文献59-61
• 全文总结61-62
• 综述 心脏发育和再生过程中心肌细胞的增殖调节62-69
• 参考文献67-69
• 发表文章及工作经历69-70
• 致谢70

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4 王道生,陈星织,张克平;蜂毒对离体乳鼠心肌细胞的影响(简报)[J];中药通报;1985年02期

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本文编号：562424