雷公藤对ITP患者T细胞亚群IDO与TTS表达的影响

发布时间：2017-07-20 11:04

  本文关键词：雷公藤对ITP患者T细胞亚群IDO与TTS表达的影响

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【摘要】：背景：免疫性血小板减少症(Immune thrombocytopenia,ITP)是由于自身反应性T和B淋巴细胞被血小板自身抗体激活,机体发生一系列免疫反应,导致体内血小板生成减少,破坏增多的自身免疫性疾病。ITP患者具有皮下粘膜出血、骨髓巨核细胞增多等临床特点,严重者还会导致内脏出血。雷公藤(Tripterygium wilfordii,TW)具有免疫抑制效应,是临床常用的治疗自身免疫性疾病的一味具有抗炎、免疫抑制效应的中药。吲哚胺2,3-双加氧酶(Indoleamine2,3-dioxygenase,IDO)通过介导色氨酸沿犬尿氨酸的代谢途径来诱导和维持机体的外周免疫耐受。而色氨酰-tRNA合成酶(Tryptophanyl-tRNAsynthetase,TTS)则是通过将色氨酸加载到它特异的tRNA上,形成蛋白复合物拮抗IDO对色氨酸的消耗参与机体免疫反应。本研究通过观察临床ITP患者使用雷公藤治疗的疗效,同时检测ITP患者雷公藤治疗前后T细胞中IDO与TTS表达的情况,了解雷公藤对ITP患者IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径的影响。目的：1.观察ITP患者使用雷公藤的疗效；2.检测雷公藤使用前后,ITP患者T细胞中IDO与TTS表达的变化情况,了解雷公藤对ITP患者IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径的影响；3.通过检测雷公藤与地塞米松分别刺激ITP患者PBMCs细胞后,患者T细胞IDO与TTS表达的变化情况,进一步验证雷公藤、地塞米松对ITP患者IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径的影响。方法：1.研究对象的纳入：临床收治初诊或复发的ITP患者25例,排除糖尿病、结核、肝炎、消化道溃疡、高血压等疾病。抽血前至少30天未使用免疫抑制剂治疗。纳入对象均采用雷公藤多甙片每日按每千克体重1-1.5mg的剂量进行治疗。在治疗前及治疗后第5天抽取患者肝素抗凝全血标本。选取健康人25例为正常对照组,均不做任何治疗处理。2.单个核细胞的分离与培养：采集患者和健康对照人群的肝素抗凝血标本l0ml,用淋巴细胞分离液梯度分离单个核细胞,吸取中间白膜层细胞,用PBS洗涤两次后,调整细胞浓度至5×106/ml,用配制好的改良型1640培养基进行培养,并分别用2nM的雷公藤溶液和luM的地塞米松溶液与单个核细胞共同培养12个小时。3.流式细胞术(FCM)检测PBMCs坏死率：收集培养12小时后的细胞,将细胞浓度调整为5×105个/ml。每管加碘化丙啶(Propidium,PI)5ul,室温避光孵育15min后上机检测。4.检测IDO与TTS的表达：表染CD4、CD8抗体,破膜后胞内染IDO与TTS抗体后,上机检测CD4+与CD8+细胞中IDO与TTS表达的变化情况。同时用RT-PCR检测IDO、 TTS mRNA的表达。结果：1.雷公藤治疗ITP患者临床有效率为80%。2.FCM检测雷公藤治疗前后ITP患者T细胞中IDO与TTS的表达结果：与正常对照组相比,ITP患者CD4+与CD8+细胞中IDO的表达量降低,而TTS的表达量则明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。有效组治疗后,患者CD4+与CD8+细胞中IDO的表达量与治疗前相比明显上升,TTS的表达量则明显下降,差异有统计学意义(P0.05)。但在治疗无效组中,患者CD4+与CD8+细胞中IDO与TTS的表达量与治疗前相比均无明显差异(P0.05)。3.RT-PCR检测雷公藤治疗前后IDO和TTS mRNA的表达结果：有效组治疗前PBMCs的IDO mRNA的表达量较正常对照组低,而TTS mRNA表达量较正常对照组高,差异均有统计学意义(P0.05)。雷公藤治疗后,PBMCs中IDO的表达量比治疗前增高,TTS的表达量减低,差异均有统计学意义(P0.05)。4.PI检测PBMCs坏死率：正常对照组、病人空白对照组、溶剂对照组、雷公藤处理组、地塞米松处理组中PBMCs坏死率分别为：0.70%、0.46%、0.70%、0.94%、0.79%。所测孔中PBMCs坏死率均1%。5.FCM检测药物刺激后T细胞中IDO和TTS的表达结果：ITP患者空白对照CD4+与CD8+细胞中IDO的表达量与正常对照组相比降低,TTS表达量增加,差异有统计学意义(P0.05)。雷公藤处理后的患者CD4+与CD8+细胞中IDO的表达量较患者空白对照中CD4+与CD8+细胞中IDO的表达量增高,TTS的表达量降低,差异有统计学意义(P0.05)。地塞米松处理后患者CD4+与CD8+细胞中IDO的表达量较患者空白对照增高,TTS的表达量减低,差异有统计学意义(P0.05)。溶剂对照组与病人空白对照组之间、雷公藤处理组与地塞米松处理组之间CD4+与CD8+细胞中IDO与TTS的表达量无明显变化(P0.05)。6. RT-PCR检测药物作用后PBMCs中IDO和TTS的mRNA表达结果：ITP患者空白对照的PBMCs中IDO mRNA表达与正常对照相比减低,TTS表达量增加,差异有统计学意义(P0.05)。雷公藤处理后患者PBMCs中IDO mRNA表达较患者空白对照增高,TTS的表达量下降,差异有统计学意义(P0.05)。地塞米松处理后PBMCs中IDO mRNA表达较患者空白对照增加,TTS的表达降低,差异有统计学意义(P0.05)。溶剂对照组与病人空白对照组之间、雷公藤处理组与地塞米松处理组之间IDO与TTS的mRNA表达无明显变化(P0.05)。结论：雷公藤对提升ITP患者的血小板有明显疗效,与地塞米松相似,也是通过IDO/TTS介导的色氨酸代谢途径发挥作用。临床有望使用雷公藤替代糖皮质激素对ITP患者进行治疗,以避免患者因便用糖皮质激素而出现的小良反应。
【关键词】：雷公藤 免疫性血小板减少性紫癜 吲哚胺2 3-双加氧酶 色氨酰-tRNA合成酶
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R558.2
【目录】：

• 摘要3-6
• Abstract6-11
• 引言11-15
• 第一章 雷公藤多甙片治疗ITP患者的临床疗效研究15-18
• 1.1 材料与方法15-16
• 1.1.1 研究对象15
• 1.1.2 治疗方法15
• 1.1.3 疗效判定标准15-16
• 1.2 结果16
• 1.3 讨论16-18
• 第二章 雷公藤对ITP患者IDO、TTS的影响18-30
• 2.1 材料18-20
• 2.1.1 研究对象18
• 2.1.2 主要试剂和耗材18-19
• 2.1.3 主要仪器19-20
• 2.1.4 主要溶剂的配制20
• 2.2 实验方法20-23
• 2.2.1 分离患者PBMCs20-21
• 2.2.2 流式细胞术检测T细胞亚群上IDO和TTS的表达21
• 2.2.3 RT-PCR检测单个核细胞中IDO和TTS mRNA的表达21-23
• 2.3 统计学分析23
• 2.4 实验结果23-27
• 2.4.1 流式细胞术检测雷公藤治疗前后患者T细胞上IDO与TTS的表达结果23-26
• 2.4.2 RT-PCR检测单个核细胞中IDO和TTS mRNA的表达结果26-27
• 2.5 讨论27-30
• 第三章 雷公藤、地塞米松刺激对ITP患者IDO、TTS表达的影响30-43
• 3.1 材料30-32
• 3.1.1 研究对象30
• 3.1.2 主要试剂和耗材30-31
• 3.1.3 主要仪器31-32
• 3.1.4 主要溶剂的配制32
• 3.2 实验方法32-36
• 3.2.1 分离患者PBMCs32-33
• 3.2.2 药物与PEMCs共培养33
• 3.2.3 单染PI检测药物作用后PBMCs的坏死情况33-34
• 3.2.4 流式细胞术检测T细胞亚群上IDO和TTS的表达34
• 3.2.5 RT-PCR检测单个核细胞中IDO和TTS mRNA的表达34-36
• 3.3 统计学分析36
• 3.4 实验结果36-41
• 3.4.1 药物作用后PBMCs的坏死率36-37
• 3.4.2 药物作用后T细胞上IDO与TTS的表达37-40
• 3.4.3 PCR检测单个核细胞中IDO和TTS基因水平的表达结果40-41
• 3.5 讨论41-43
• 结语43-44
• 参考文献44-47
• 附录47-55
• 附录1 ：综述47-53
• 参考文献50-53
• 附录253-54
• 附录354-55
• 在校期间发表论文情况55-56
• 致谢56

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