小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

发布时间：2017-07-20 11:06

  本文关键词：小鼠骨髓源性树突状细胞体外诱导培养体系的构建

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【摘要】：目前的研究认为动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的发生、发展到转归是一种慢性炎症反应的病理过程,有大量的免疫细胞和炎症介质参与其中。树突状细胞(dendritic cells,DCs)作为目前已知的体内功能最强大的专职抗原提呈细胞(antigen-presenting cell,APC),也是唯一能在体内直接激活初始T细胞的抗原提呈细胞,在诱导T淋巴细胞活化,刺激初始T淋巴细胞增殖、介导免疫耐受等方面发挥着重要作用。然而DCs在体内的数量较少,仅占外周单核细胞的1%左右,如此稀少的数量给其免疫功能的研究带来了不小的困难。因此,能够在体外准确、高效的培养出DCs并对其鉴定,为其后续再AS小鼠模型上进行免疫功能实验奠定了基础。目的:1通过提取小鼠骨髓细胞,采用rmGM-CSF、rmIL-4等细胞因子联合诱导,建立一种在体外环境下培养DCs的体系,为课题后续的研究提供基础。2对体外环境下培养出来的DCs从形态学、表面分子的表达情况及对同种异基因T细胞的刺激增殖能力三个方面进行鉴定。方法:1小鼠骨髓源性DCs的体外诱导培养颈椎脱臼法将雄性C57BL/6小鼠处死,在无菌条件下取出小鼠双侧股骨、胫骨,用1ml注射器抽取RPMI1640培养液反复冲洗骨髓腔,冲洗液经400目滤网过滤,去除组织碎片。加入红细胞裂解液裂解红细胞,用RPMI1640全培养液配成细胞悬液,细胞计数板计数,调整细胞浓度为5x105/ml,加入细胞因子,分装于培养瓶,置入37℃、5%CO2培养箱中培养。培养48h后收集悬浮细胞,离心去除上清液,补充培养液及细胞因子,以后隔日半量换液,第5天将收集的悬浮细胞分成两组,一组在培养液中加入lps(1μg/ml)刺激成熟,培养至第7天收集悬浮细胞,另一组不做lps刺激处理,培养至第7天收集悬浮细胞。2小鼠骨髓源性dcs的鉴定2.1细胞形态学观察倒置显微镜下动态观察dcs的生长与形态的变化并摄影记录2.2流式检测dcs表面分子分别收集两组细胞离心后去上清,细胞计数,按照流式抗体说明书进行抗体标记及同型对照标记,4℃避光孵育30min,离心洗涤,流式检测两组细胞表面cd80、cd86、mhc-Ⅱ的表达情况2.3mtt法检测同种异基因混合淋巴细胞反应(mlr)颈椎脱臼法处死balb/c小鼠,无菌条件下取出其脾脏,剪碎研磨,得到细胞悬液,用淋巴细胞分离液分离出单核细胞,尼龙毛柱法获得同种异体t细胞作为反应细胞,调整密度为2x106/ml。取上述方法获得的imdcs和mdcs,分别按照dc:t细胞比例为1:5、1:10、1:20、1:40的反应比铺于96孔板中,在37℃、5%co2条件下共培养72h,共培养结束前4h,在每孔中加入20μlmtt继续培养4h,每孔吸取培养液后加入150μl的dmso,室温震荡,酶标仪测定各孔的吸光度(a)值,检测波长为570nm。结果:1.细胞形态学观察倒置显微镜下可见培养48h后,部分细胞开始出现半悬浮状态,并形成细胞集落,少量细胞表面出现毛刺状突起。培养的第5天镜下观察可见大量细胞集落,细胞集落表面可见大量长短不一的突起,细胞体积进一步增大,呈悬浮状态。加入lps刺激48h后,可见大量毛刺状突起的dcs从集落释放出来,呈游离状态,而未加lps刺激的dcs仍呈集落聚集生长。2.流式检测dcs表面分子细胞培养第7天分别收集两组细胞用流式细胞术分析其表面分子的表达情况。结果显示,两组细胞均高表达cd11c分子,纯度90%。未加lps刺激组的dcs低表达cd80、cd86、mhc-Ⅱ分子,细胞表现为未成熟状态,而在lps刺激组这些表面分子则呈现出明显的高表达,细胞表现为成熟状态。3.MTT法检测同种异基因混合淋巴细胞反应单因素析因方差分析结果显示两组DCs刺激T细胞增殖的能力随着DCs所占比例的增大而增强,在相同比例条件下,imDCs刺激T细胞增殖的能力显著低于mDCs刺激T细胞增殖的能力,差异具有统计学意义(P0.05)。结论:本实验通过提取小鼠骨髓细胞,采用rmGM-CSF、rmIL-4等细胞因子联合诱导,建立了一种在体外环境下培养DCs的体系,并从形态学、表面分子的表达情况及对同种异基因T细胞的刺激增殖能力三个方面对DCs加以鉴定。此方法培养出的DCs细胞形态典型,为后续的实验研究奠定了基础。
【关键词】：小鼠 树突状细胞 细胞培养
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 英文缩略词表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-17
• 资料与方法17-22
• 结果22-27
• 讨论27-34
• 结论34-35
• 参考文献35-39
• 附录39-40
• 致谢40-42
• 综述42-48
• 参考文献46-48

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本文编号：567671