治疗性低温对缺氧期心肌细胞自噬流的影响及机制研究

发布时间：2017-07-31 18:37

  本文关键词：治疗性低温对缺氧期心肌细胞自噬流的影响及机制研究

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【摘要】：研究背景随着国民生活方式的改变,我国冠心病的发病率正逐年攀升并呈年轻化趋势。而急性心肌梗死(Acute myocardial infarction, AMI)是冠心病中最为凶险的类型,每年在中国大约350万人由于心血管疾病而死亡,是各种疾病中死亡率最高的疾病之一,其中有半数以上的人死于心肌梗死,甚至猝死。因此及时提出有效防治AMI的措施和手段将刻不容缓。治疗性低温(Therapeutic Hypothermia, TH)是经物理方法降低细胞代谢速率,将患者体温降至预期水平(32℃左右)从而治疗疾病的新方法。近年来,国外率先采用TH治疗脑卒中等脑血管疾病,并取得令人瞩目的成果。但TH在心血管病治疗领域仍处在早期研究阶段,TH疗法对心肌缺氧损伤的作用及其机制研究鲜有报道。心肌缺氧期间,由于细胞能量生成减少,细胞内酸中毒,使溶酶体膜稳定性降低,导致细胞损伤；TH能有效调节减慢能量代谢,稳定细胞内酶活性,保护缺氧损伤细胞；自噬(Autophagy)往往在营养缺乏等应激条件下被进一步激活,自噬表达上调,从而增加心肌对缺血缺氧的耐受性,但是过度自噬又会促进细胞死亡,称为自噬性细胞死亡。现有部分研究表明：TH能在缺氧期间保护器官功能并改善细胞活性,但在缺氧期间TH对自噬的影响以及相关的机制未见文献报道。本课题为了探讨TH在心肌缺氧期间对自噬表达的影响以及调控自噬的相关机制,以H9c2大鼠心肌细胞株作为实验对象,将H9c2心肌细胞置于含95%氮气等混合气体的缺氧盒中模拟缺氧,磷酸盐缓冲液(PBS)代替培养基模拟缺血。先通过对比不同缺氧时间中TH对自噬表达的影响,再对比单纯缺氧与TH处理在应用雷帕霉素后磷酸化mTOR、 S6等mTOR相关通路下游效应蛋白的表达差异,明确TH对自噬的影响及其机制。目的为了探讨治疗性低温(TH)在缺血期对心肌细胞自噬及自噬流的影响,并探讨相关机制。方法使用大鼠心肌细胞株H9c2,置于含95%氮气等混合气体的缺氧盒模拟缺氧,PBS代替完全培养基模拟缺血。第一部分实验：在不同缺氧时间中,单纯缺氧与TH处理后的细胞状态及活性的差异：实验分组：1)空白对照组(Control) 2)单纯缺氧组(Hypoxia)3)TH处理缺氧组(TH),分别置于缺氧盒中模拟缺氧1 h、2 h、3 h,采用光学显微镜评估细胞状态,台盼蓝拒染实验判断活性情况。第二部分实验：进一步探讨TH组与单纯缺氧组缺氧1-3 h的自噬水平及3h自噬流表达水平的差异：实验分组：1)空白对照组(Control) 2)单纯缺氧组(Hypoxia)3) TH处理缺氧组(TH),置于缺氧盒中模拟缺氧1-3 h,免疫印迹法(Western Blot)观察自噬相关蛋白自噬微管相关蛋白轻链3B (LC3B)、 p62、 Beclin-1,最后用透射电子显微镜观察缺氧3h各组自噬泡形成,腺病毒GFP-mRFP-LC3荧光瞬时转染技术明确自噬流表达水平。通过药物干预自噬水平,观察TH在缺氧心肌细胞中的作用,实验分组：1)单纯缺氧组(Hypoxia)2) TH处理缺氧组(Hypoxia+TH) 3) 3甲基腺嘌呤干预单纯缺氧组(Hypoxia+3-MA) 4) 3甲基腺嘌呤干预TH处理缺氧组(Hypoxia +TH+3-MA)5)雷帕霉素干预单纯缺氧组(Hypoxia+rapamycin) 6)雷帕霉素干预TH处理缺氧组(Hypoxia+TH+rapamycin),3-MA (10 mM)、雷帕霉素(0.1 μM)相关组造模前2h给药,同时放入缺氧盒中模拟缺氧,免疫印迹法(Western Blot)检测自噬相关蛋白LC3B, p62的表达情况,台盼蓝拒染实验检测细胞活性。第三部分实验：进一步应用雷帕霉素预处理观察缺氧期TH影响自噬表达水平中在mTOR信号通路的相关机制,实验分组：1)单纯缺氧组(Hypoxia)2)TH处理缺氧组(TH)3)雷帕霉素干预单纯缺氧组(Hypoxia+raparaycin) 4)雷帕霉素干预TH处理缺氧组(TH+raparaycin),雷帕霉素(0.1μM)相关组造模前2小时给药,同时放入缺氧盒中模拟缺氧,免疫印迹法(Western Blot)检测自噬相关蛋白LC3B, p62,以及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白磷酸化mTOR、核糖体蛋白S6(S6)的表达情况。统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件处理实验数据,数据以均数±标准差(mean±SD)表示,组间差别统计采用单因素方差分析比较,各组均数间两两比较采用Bonferroni检验。P0.05被认为差异有统计学意义。实验均独立重复3次。研究结果1、在不同缺氧时间中,单纯缺氧与TH处理后细胞状态差异：在光学显微镜下,随着缺氧时间的延长,越来越多的细胞发生皱缩,变圆,与缺氧组相比,TH处理的细胞在缺氧3h细胞形态明显改善(图1-1)；台盼蓝拒染实验结果也表明,随着缺氧时间的延长,细胞活性明显下降,而TH能有效减少细胞死亡(图1-2)。2、进一步探讨TH组与单纯缺氧组缺氧3h后自噬活性和自噬流表达水平的差异：缺氧刺激后,免疫印迹法(Western Blot)检测自噬相关蛋白,显示随着缺氧时间延长(缺血1、2、3 h),单纯缺氧组与对照组相比LC-3B表达显著增高(p0.01)(图2-1.B),p62表达也相应显著降低(p0.01)(图2-1.C)；其中缺氧处理2h和3h的时候,而单纯缺氧组与TH处理组相比LC-3B表达显著增高(2小时p0.05,3小时p0.01),p62表达也相应显著降低(p0.01)；但Beclin-1的表达水平在缺氧3h处理后单纯缺氧组与对照组相比显著增高(p0.01),但单纯缺氧组和TH处理组之间并无统计学差异(图2-1,D)。为了明确在缺氧3h时TH对自噬小体形成以及自噬流的影响,应用透射电子显微镜观察,对照组、单纯缺氧组、TH组中自噬小体分别是：2.33±1.53(个/HPF),7.00±1.00(个/HPF),3.67±1.15(个/HPF),统计结果表明单纯缺氧组明显高于对照组(p0.01),也明显高于TH组(p0.05),TH组与对照组无统计学差异(图2-2)。表明缺氧损伤能大量促进自噬小体形成,TH能部分减少缺氧损伤后的自噬小体。自噬流,即自噬小体的产生与消逝的动态过程,被认为是更为科学地评价自噬水平的方式,我们进一步探讨TH在缺氧下对自噬流调控情况。我们应用腺病毒GFP-mRFP-LC3瞬时转染细胞,观察到缺氧3h后,对照组、单纯缺氧组、TH组中的GFP(点/单个细胞)分别是：4.33±2.52,63.00±9.17,31.00±11.14；mRFP(点/单个细胞)分别是8.33±5.13,139.00±14.11,43.67±18.93。统计结果表明在GFP和mRFP中单纯缺氧组均明显高于对照组和TH组(p0.01),TH组与对照组无统计学差异,即黄点(GFP与mRFP融合的部分)中单纯缺氧组均明显高于对照组和TH组(p0.01),TH组与对照组无统计学差异(图2-3)。上述结果表明,缺氧能显著促进自噬流,而TH处理能减少缺氧引起的自噬小体以及自噬溶酶体的形成,从而抑制自噬流。通过药物干预自噬活性水平,验证TH在缺氧心肌细胞中的作用及相关机制：应用3-MA及雷帕霉素干预缺血期心肌细胞自噬,观察TH对缺氧心肌自噬对细胞活性的调控作用。作为PI3K抑制剂,3-MA被认为是有效抑制自噬的工具药,通过抑制自噬早期阶段自噬小体形成,从而减少自噬小体及其重要组成部分LC-3B的表达抑制自噬。免疫组化结果表明,经过3-MA(10mM)预处理2h后(1组与3组相比,2组与4组相比),LC-3B表达减少,且p62的表达增加(图2-4.A,B,C)。而台盼蓝拒染实验结果表明缺氧3小时后,3-MA进一步加重心肌细胞损伤,表明缺氧期减少自噬水平对细胞活性并未获益(图2-4.D)。与此同时,4组较3组细胞活性更低,表明一定水平的自噬有助于保护缺氧期间的心肌细胞。雷帕霉素通过抑制mTOR蛋白有效激活自噬被普遍应用于体内外自噬相关实验中,免疫印迹实验结果表明,经过雷帕霉素(0.1μM)预处理2 h后(1组与5组相比,2组与6组相比),LC-3B表达增加,且p62的表达减少(图2-4.E,F,G)。细胞活性结果表明缺氧3h后,雷帕霉素减轻心肌细胞损伤,表明缺氧期间TH保护心肌细胞不仅仅通过对自噬水平的调节,还存在其他细胞保护机制(图2-4.H)。3、雷帕霉素预处理观察缺氧期TH影响自噬表达水平中在mTOR信号通路的相关机制：mTOR被认为是在哺乳动物细胞中负向调控自噬的关键蛋白。核糖体蛋白S6(S6)是mTOR下游的效应蛋白,磷酸化S6被认为是mTOR激活程度重要标记蛋白。因此,我们检测了各组mTOR和S6的磷酸化程度。缺氧刺激后,应用免疫印迹法检测自噬相关蛋白,单纯缺氧组与对照组相比磷酸化mTOR、 S6的显著减少(p0.01)；而TH处理组与单纯缺氧组相比磷酸化mTOR和S6蛋白表达显著增多(p0.01),表明TH处理能部分恢复缺氧后被抑制的mTOR通路相关蛋白中的磷酸化mTOR. S6。雷帕霉素是自噬激动剂,同时也是mTOR蛋白的抑制剂,为了验证mTOR通路在TH干预缺氧引起的自噬过程中的作用,我们应用雷帕霉素预处理2 h,western blot法检测自噬相关蛋白,雷帕霉素预处理后的两组与雷帕霉素未处理的两组(即3组与1组相比；4组与2组相比)相比显示LC-3B表达增高(p0.05),p62表达也相应显著降低(p0.01),表明雷帕霉素能有效上调两组的自噬活性水平(图3-1.B,C)；然而,雷帕霉素无法进一步降低单纯缺氧后(1组与3组)的磷酸化mTOR和S6蛋白表达水平(p0.05),却可以抑制TH处理后(2组与4组)的磷酸化mTOR和S6蛋白表达水平(p0.05)(图3-1.D,E),雷帕霉素处理后的缺氧组与该药处理后的TH组(3组与4组)相比,磷酸化的mTOR和S6并无统计学差异(p0.05),表明雷帕霉素处理后能充分抑制mTOR下游信号通路。总而言之,雷帕霉素处理后的两组自噬相关蛋白表达水平明显升高,表明雷帕霉素能促进缺氧组和TH组的自噬表达水平,且mTOR通路下游相关蛋白表达减少,表明在缺氧期TH能有效激活mTOR通路,且部分通过mTOR通路下调自噬水平。结论1、本研究通过建立诱导H9c2大鼠心肌细胞株缺氧损伤模拟心肌缺血,缺氧3 h后可明显造成H9c2心肌细胞损伤,表明心肌缺氧损伤模型构建成功,且TH能有效减轻心肌细胞缺氧损伤,为进一步探讨TH对缺氧心肌的自噬水平的影响及相关机制研究提供了研究基础。2、本研究通过缺氧处理H9c2心肌细胞模拟心肌缺血损伤,TH处理干预细胞损伤,检测自噬及自噬流水平,表明TH部分抑制缺氧上调的自噬及自噬流。并进一步应用自噬抑制剂3-甲基腺苷酸、自噬激动剂雷帕霉素预处理后再缺氧处理H9c2心肌细胞模拟的心肌缺血损伤,明确TH在缺氧心肌细胞中的作用：(1)一定水平的自噬对维持细胞活性至关重要；(2)缺氧期间TH保护心肌细胞不仅仅通过对自噬水平的调节,还存在其他细胞保护机制。3、本研究通过应用自噬激动剂雷帕霉素预处理后再缺氧处理H9c2心肌细胞模拟的心肌缺血损伤,探讨TH在缺氧心肌细胞中对自噬调控的相关机制,明确了：TH能有效激活缺氧期mTOR通路,且部分通过mTOR通路下调自噬水平。
【关键词】：治疗性低温 自噬流 mTOR H9c2细胞 缺氧损伤
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R54
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-18
• 第一章 H9c2心肌细胞株的培养和缺氧模型建立18-28
• 1.1 研究背景18-19
• 1.2 方法19-24
• 1.3 结果24-26
• 1.4 讨论26-28
• 第二章 治疗性低温对自噬活性及自噬流水平的影响及作用28-54
• 2.1 研究背景28-30
• 2.2 方法30-42
• 2.3 结果42-49
• 2.4 讨论49-54
• 第三章 治疗性低温下调缺氧后自噬活性的mTOR信号通路相关机制研究54-61
• 3.1 研究背景54-55
• 3.2 方法55-56
• 3.3 结果56-59
• 3.4 讨论59-61
• 全文总结61-62
• 参考文献62-69
• 攻读学位期间成果69-70
• 致谢70-72

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本文编号：600546