葡激酶改造：定点突变与聚乙二醇修饰联合应用及初步功能验证

发布时间：2017-08-11 02:02

  本文关键词：葡激酶改造：定点突变与聚乙二醇修饰联合应用及初步功能验证

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【摘要】：目的:通过对葡激酶蛋白(SAK,S)基因序列进行定点突变,然后在多种条件下对突变蛋白进行聚乙二醇修饰,筛选出最优修饰条件。并通过分子筛分离得到较高纯度修饰蛋白,并对其生物活性进行初步验证。方法:根据S蛋白晶体结构及抗原位点选择突变位点,设计突变引物,将S蛋白上选定的氨基酸突变为半胱氨酸;将突变质粒通过化学转化进BL21(DE3)感受态,并利用经典原核表达技术,在大肠杆菌中表达突变蛋白S-cys;利用离子亲和层析、离子交换层析、分子筛等方法分离纯化目的蛋白;对目的蛋白在不同条件下进行聚乙二醇修饰,观察并评价修饰温度、修饰时间、蛋白质:修饰剂摩尔比等因素对修饰率的影响;二次分离,将修饰蛋白与未成功修饰蛋白分离开来,得到较高纯度的修饰蛋白peg-S-cys,并通过纤维蛋白平板溶圈实验和动物栓塞模型的构建初步对其生物活性进行验证。结果:(1)成功将选定氨基酸突变为半胱氨酸。(2)原核表达、纯化后得到了纯度较高的S-cys蛋白。(3)在多种条件下对S-cys蛋白进行修饰,根据修饰后SDS-PAGE结果得到最佳修饰条件。(4)应用分子筛分离纯化,成功获得纯度较高的peg-S-cys蛋白。(5)初步验证peg-S-cys具有溶栓活性。结论:通过对蛋白质基因序列的定点突变,成功实现了蛋白质的聚乙二醇定点修饰,在体外和体内初步验证其活性,为蛋白质改造提供了一种新的方法与思路。
【关键词】：蛋白质改造 聚乙二醇修饰 定点突变 活性验证
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-5
• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-11
• 1 材料与方法11-18
• 2 实验结果18-25
• 3 讨论25-28
• 全文总结28-29
• 参考文献29-31
• 文献综述31-35
• 参考文献34-35
• 致谢35-36
• 攻读学位期间发表的论文、参加的学术会议及参与的科研项目36

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 杨可;杨震;汪德强;雷寒;周建中;;重组葡激酶的表达纯化及纤溶活性鉴定[J];重庆医科大学学报;2012年03期

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本文编号：653665