TLR4-MyD88通路在DFMG抗LPC诱导内皮细胞损伤中的作用

发布时间：2017-08-12 07:38

  本文关键词：TLR4-MyD88通路在DFMG抗LPC诱导内皮细胞损伤中的作用

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【摘要】：目的:探讨一种新型活性化合物,7-二氟甲氧基-5,4’-二甲氧基金雀异黄素(7-difluoromethoxy-5,4’-dimethoxygenistein,DFMG),是否通过抑制TLR4-MyD88信号转导通路拮抗溶血性磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC-12)氧化应激损伤。方法:体外培养HUVEC-12细胞,TLR4-cDNA质粒和TLR4-shRNA质粒分别转染细胞24h得到TLR4过表达HUVEC-12细胞和TLR4沉默HUVEC-12细胞。用RT-qPCR和Western blotting鉴定是否分别成功过表达和沉默TLR4。用30μmol/L的LPC处理以上两种细胞24 h,然后加入3.0μmol/L的DFMG孵育24h。应用ELISA分析DFMG对LPC诱导损伤的HUVEC-12细胞TLR4-MyD88通路途径中IL-6、TNF-α的影响,采用Western blotting检测DFMG对于LPC诱导损伤的HUVEC-12细胞TLR4-MyD88通路途径中TLR4、My D88的影响。结果:①TLR4-cDNA质粒转染后,相对于空白对照组,荧光定量PCR结果显示TLR4过表达组细胞的TLR4基因表达增加(P0.01),Western blotting结果显示TLR4过表达HUVEC-12细胞的TLR4蛋白表达增加。tlr4-shrna质粒转染后,相对于空白对照组,荧光定量pcr结果显示tlr4沉默huvec-12细胞的tlr4基因表达明显降低,差异具有统计学意义(p0.01)。westernblotting结果显示tlr4沉默huvec-12细胞的tlr4蛋白表达明显降低。验证tlr4-cdna质粒和tlr4-shrna质粒分别转染后获得tlr4过表达huvec-12细胞和tlr4沉默huvec-12细胞。②elisa结果显示:lpc损伤组、tlr4过表达组和tlr4过表达+lpc损伤组的il-6、tnf-α分泌量相对空白对照组均明显上升(p0.05),其中tlr4过表达+lpc损伤组增高最为显著(p0.05)。tlr4沉默组和tlr4沉默+lpc损伤组的il-6、tnf-α分泌量较lpc损伤组均明显下降(p0.05)。tlr4过表达+lpc损伤+dfmg组的il-6、tnf-α表达量与tlr4过表达+lpc损伤组比较显著下降(p0.05)。tlr4沉默+lpc损伤+dfmg组的il-6、tnf-α表达量与tlr4沉默+lpc损伤组和lpc损伤组比较均明显下降(p0.05)。dfmg组的il-6、tnf-α分泌量同空白对照组相当,差异无统计学意义(p0.05)。③westernblotting结果显示:lpc损伤组、tlr4过表达组和tlr4过表达+lpc损伤组的tlr4、myd88蛋白表达量相对空白对照组有所上升,其中tlr4过表达+lpc损伤组上升最为明显。tlr4沉默组和tlr4沉默+lpc损伤组所表达的tlr4、myd88蛋白相对于lpc损伤组明显下降。tlr4过表达+lpc损伤+dfmg组的tlr4、myd88蛋白表达量与tlr4过表达+lpc损伤组比较显着下调。而tlr4沉默+lpc损伤+dfmg组比tlr4沉默+lpc损伤组和lpc损伤组的TLR4、MyD88蛋白量都明显减少。DFMG组的TLR4、MyD88蛋白表达量与空白对照组差异不明显。结论:①TLR4-MyD88信号通路介导LPC诱导的HUVEC-12细胞氧化应激损伤。②通过抑制TLR4-MyD88信号转导拮抗LPC的诱导HUVEC-12细胞损伤是DFMG保护血管内皮细胞氧化应激损伤作用的机制之一。
【关键词】：DFMG 溶血性磷脂酰胆碱 人脐静脉内皮细胞 TLR4 MyD88
【学位授予单位】：湖南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-13
• 引言13-15
• 第一章 TLR4基因过表达对DFMG抗LPC诱导内皮细胞损伤和TLR4-MyD88通路的影响15-33
• 1. 实验材料15-17
• 1.1 细胞、质粒和感受态细胞15
• 1.2 实验试剂15-16
• 1.3 实验仪器16-17
• 1.4 特殊试剂配制17
• 2. 实验方法17-24
• 2.1 HUVEC-12细胞的培养17-18
• 2.2 TLR4 cDNA质粒的转染18-19
• 2.3 实时定量PCR分析.19-22
• 2.4 Western blotting22-23
• 2.5 ELISA测定23-24
• 2.6 DFMG对LPC诱导的TLR4过表达HUVEC-12细胞TLR4和MyD88蛋白表达的影响24
• 2.7 统计学分析24
• 3. 结果24-33
• 3.1 TLR4 cDNA转染对TLR4基因表达的影响24-27
• 3.2 DFMG对LPC诱导TLR4过表达HUVEC-12细胞TNF-α 和IL-6分泌的影响27-31
• 3.3 DFMG对LPC诱导TLR4过表达HUVEC-12细胞TLR4和My D88蛋白表达的影响31-33
• 第二章 TLR4基因沉默对DFMG抗LPC诱导内皮细胞损伤和TLR4-MyD88通路的影响33-43
• 4. 实验材料33
• 4.1 细胞、质粒和感受态细胞33
• 4.2 实验试剂33
• 4.3 实验仪器33
• 4.4 特殊试剂配制33
• 5. 实验方法33-35
• 5.1 HUVEC-12细胞的培养33
• 5.2 TLR4 shRNA质粒的转染33-34
• 5.3 实时定量PCR分析34
• 5.4 Western blotting ..34
• 5.5 ELISA测定34-35
• 5.6 DFMG对LPC诱导的TLR4过表达HUVEC-12细胞TLR4和MyD88蛋白表达的影响35
• 5.7 统计学分析35
• 6. 结果35-43
• 6.1 TLR4 shRNA转染对TLR4基因表达的影响35-38
• 6.2 DFMG对LPC诱导TLR4沉默HUVEC-12细胞TNF-α 和IL-6分泌的影响38-41
• 6.3 DFMG对LPC诱导TLR4沉默HUVEC-12细胞TLR4和MyD88蛋白表达的影响41-43
• 讨论43-46
• 结论46-47
• 参考文献47-51
• 综述51-60
• 参考文献56-60
• 英文缩写词表60-61
• 攻读硕士学位期间的主要成果61-62
• 致谢62-63

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本文编号：660491