超声微泡介导硫化氢传输减轻心肌缺血再灌注损伤的研究

发布时间：2017-09-10 01:20

  本文关键词：超声微泡介导硫化氢传输减轻心肌缺血再灌注损伤的研究

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【摘要】：研究背景急性心肌梗死具有很高的发病率和死亡率。早期有效地恢复缺血心肌的血流灌注是治疗的关键。然而,恢复缺血心肌血流再灌注的过程中,其本身亦会造成心肌损伤,称为心肌缺血再灌注损伤(Myocardial Ischemia Reperfusion Injury,MIRI)。动物实验表明急性心肌梗死再灌注治疗后,梗死心肌中约有50%归因于MIRI.因此,减轻MIRI具有重要的临床意义。MIRI的发生机制复杂,迄今未完全阐明,可能的机制包括氧化应激损伤、细胞内钙离子超载、心肌能量代谢障碍、心肌细胞凋亡、炎症反应和pH反常等。目前,有不少研究致力于探索MIRI的防治策略,包括物理方法干预(如缺血预处理、缺血后处理、远处缺血适应和低温疗法等)和药物干预(如腺苷、心房钠尿肽、促红细胞生成素、艾塞那肽、环孢素A、亚硝酸盐等)两种。尽管在动物实验中发现很多治疗策略在MIRI中发挥心脏保护作用,但在临床转化过程中未能使患者获益。近期研究发现,硫化氢(Hydrogen Sulfide,H2S)是继一氧化碳和一氧化氮之后的第三种气体信号分子,在心血管系统发挥着重要的生物学作用,在MIRI防护方面尤为突出。在哺乳动物心肌中,H2S主要是通过胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-y-lyase,CSE)催化生成。通过敲除小鼠CSE基因减少内源性H2S的产生将使心肌梗死而积扩大,而小鼠心脏特异性过表达CSE基因增加内源性H2S的生成则可减小心肌梗死面积,改善心功能。外源性给予H2S同样具有心脏保护作用。研究报道,小鼠心肌缺血后再灌注即刻心腔注射硫化钠(H2S的供体),可减小72%的心梗面积,改善心功能。这一结果在临床前动物模型猪的心脏上得到进一步证实。H2S减轻MIRI的可能机制涉及：(1)抗氧化作用；(2)保留线粒体的结构和功能；(3)增加心肌细胞KATP通道的开放频率；(4)缓解心肌细胞内钙超载；(5)抑制心肌细胞凋亡；(6)减轻炎症反应。总之,H2S对MIRI有重要的调节作用,外源性给予H2S是一种十分有前景的心脏保护措施。目前,H2S的给药方法有气体吸入和供体给药两种方法。H2S由于具有难闻的臭鸡蛋气味和对呼吸道刺激性,即使很吸入很低浓度的气体仍难以耐受。H2S常用的供体是硫氢化钠和硫化钠,这两种供体注射给药后虽然能在数秒钟之内迅速增加体内的H2S浓度,但由于其降解速度快而难以在局部组织中维持较长时间的有效浓度。此外,不同器官对H2S的敏感性不同,全身给药可能会产生副反应,包括血压的急剧波动、呼吸抑制和中枢神经系统毒性。鉴于此,如能实现H2S向心肌定位输送,则可能在发挥其心脏保护作用同时又可避免这种副反应。微泡(Microbubble)是临床上使用的一种超声造影剂,由生物外壳包裹气体核心构成。微泡在超声波的作用下会产生空化效应。这一现象被广泛用于药物和基因的定位传输。近年,有研究报道超声微泡可用于治疗性气体的定位输送。例如,载NO的微泡可向心肌输送NO,增加干细胞向心肌归巢,促进血管新生；载O2的微泡可改善肿瘤的缺氧环境,增强声动力治疗效果。因此,制备包裹H2S气体的超声微泡结合局部超声波照射可有助于H2S的定位传输,具有很强的可行性,然而,目前仍未见报道。因此,本实验假设超声联合微泡可实现H2S信号分子的定位传输,从而减轻心肌缺血在灌注损伤,这可能避免H2S全身毒副作用,为防治MIRI提供一种无创方便安全的治疗方法。目的①构建高H2S载量的稳定的载硫化氢微泡(hs-MB)；②探索hs-MB对MIRI的作用及可能机制。方法1. hs-MB的制备及评价由于H2S为小分子气体,易于溢出微泡,而C3F8为大分子惰性气体,可增加微泡的稳定性,因此,为了制备具有较高稳定性和H2S载量的hs-MB,我们探索了H2S和C3F8最佳的混合比例。采用机械震荡法制备5种载不同比例的H2S和C3F8混合气体(分别为4/0、3/1、2/2、1/3、0/4)的超声微泡,显微镜观察微泡的形态,测量微泡中H2S的含量；在不同时间点(Oh、1h、6h、24h、 72h)用库尔特计数仪测定hs-MB的微泡浓度及粒径,评估其稳定性。根据微泡浓度、H2S载量和微泡稳定性优选出最佳的气体混合比例。2.超声辐照hs-MB传输H2S的实验研究①.超声辐照触发hs-MB释放H2S的体外实验在体外流动腔装置上,PBS以10ml/min的速度恒速通过,hs-MB以100μl/min泵入,在其下游用超声空化治疗仪发射的低频超声波(发射频率1.0MHz,声压1.0MPa)进行辐照,液体流出口处采用气体信号分子和生物自由基检测仪实时检测液体中H2S浓度。②.超声破坏hs-MB定位传输H2S的在体实验：9只SD大鼠随机分成Control、hs-MB和hs-MB+US组。Control组不予处理;hs-MB组经尾静脉6×109个／(kg·h)泵入hs-MB,持续30分钟;hs-MB+US组在泵入hs-MB的同时低频超声辐照心前区。对比超声检查观察hs-MB的成像效果及微泡破坏情况。观察hs-MB对大鼠血压心率和呼吸的影响。测量不同器官组织中H2S的浓度。3.超声破坏hs-MB减轻MIRI的实验研究72只SD大鼠随机分成4组(n=18)：Ⅰ.SHAM组：不拉紧左冠脉结扎线,经尾静脉6ml/(kg·h)泵入生理盐水。Ⅱ. MIRI组：拉紧左冠脉结扎线30min,经尾静脉6ml/(kg·h)泵入生理盐水。Ⅲ. c-MB+US组：拉紧左冠脉结扎线30min,经尾静脉6×109个／(kgoh)泵入普通超声微泡(全氟丙烷内核,c-MB)。低频超声辐照大鼠心前区破坏微泡。Ⅳ. hs-MB+US组：拉紧左冠脉结扎线30min,经尾静脉6×109个／(kg·h)泵入hs-MB。超声辐照方法和条件与c-MB+US组相同。在缺血心肌再灌注前5分钟开始给予干预治疗,持续30分钟。再灌注4小时后,每组取6只大鼠分别行HE染色和TUNEL染色,取另外6只大鼠测量心肌组织MDA和SOD的浓度。再灌注24小时,行超声心动图检查评估大鼠心功能后处死大鼠取出心脏行TTC/伊文思蓝双染色检测心肌缺血及梗死面积。4.统计方法运用SPSS 19.0软件进行统计学分析,所有数值均以均数±标准差(Mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析,Bonferroni进行组间多重比较。hs-MB稳定性的数据采用重复测量数据的方差分析进行比较。P0.05认为差异有统计学意义。结果1. H2S/C3F8为2/2制备的hs-MB具有较高的稳定性和H2S载量。H2S/C3F8为2/2制备的hs-MB稳定性良好,H2S载量最高,微泡浓度为(1.01±0.19)×109/mL,粒径为2.26±0.17μm,分布于0-9μm。2.超声辐照触发hs-MB释放H2S。体外实验结果显示：在输注hs-MB前,液体中H2S浓度稳定维持在0μM水平；加入hs-MB后,H2S浓度稍有增加；若同时输注hs-MB和低频超声辐照,可观察到H2S浓度显著增加并维持在3.5-4.5μM,停止微泡输注和低频超声辐照后,H2S浓度迅速降至基线水平。输注hs-MB和低频超声组液体中H2S浓度最大峰值显著高于仅输注hs-MB组(P0.05)。3.超声破坏hs-MB促进H2S的定位传输。超声破坏hs-MB定位传输H2S的在体实验结果显示：hs-MB具有良好的超声显影能力,经静脉注射后可到达心肌组织并可被低频超声破坏。hs-MB+US处理后,大鼠心肌组织和肺脏组织中H2S含量较对照组升高(均P0.05),而肾脏和肝脏组织中H2S含量无明显变化(均P0.05)。4. hs-MB+US减小心肌梗死面积。与SHAM组相比,MIRI组IS/AAR显著扩大(P0.01)。MIRI和c-MB+US组IS/AAR无显著差异(P0.05)。hs-MB+US组IS/AAR明显小于c-MB+US组(P0.05)。心肌组织HE染色示hs-MB+US组心肌纤维呈波浪状排列,肌纤维断裂程度、间隙水肿和炎症细胞浸润程度较c-MB+US组减轻。5. hs-MB+US改善大鼠MIRI后心功能。与SHAM组相比,MIRI组EDd和ESd显著增加(P0.05),LVFS和LVEF显著降低(P0.01)。MIRI和c-MB+US组ESd、EDd、LVFS和LVEF无差异(所有P0.05)。与c-MB+US组相比,hs-MB+US组ESd减小(P0.05),LVFS(P0.01)和LVEF(P0.01)明显改善,但EDd无显著差异(P0.05)。6. hs-MB+US减轻MIRI后心肌细胞凋亡。与SHAM组相比,MIRI组凋亡细胞明显增加(P0.01)。MIRI和c-MB+US组心肌细胞凋亡数目无差异(P0.05)。hs-MB+US组凋亡细胞数目明显少于c-MB+US组(P0.01)。7. hs-MB+US减轻MIRI后氧化应激。与SHAM组相比,MIRI组心肌组织中MDA含量增加(P0.01),而SOD含量减低(P0.01)。MIRI和c-MB+US组心肌组织中MDA和SOD含量无差异(P0.05)。hs-MB+US组心肌组织中MDA含量较c-MB+US组减少(P0.05),而SOD含量增加(P0.01)。8. hs-MB+US对大鼠血流动力学和呼吸的无影响。结论H2S/C3F8为2/2制备的hs-MB具有较高的稳定性和H2S载量,具有良好的超声显影效果。超声破坏hs-MB可释放H2S并增加心肌H2S浓度。hs-MB+US传输H2S信号分子减轻心肌缺血再灌注损伤,改善心功能,这种保护作用与减少心肌细胞凋亡和抑制氧化应激有关。超声联合微泡定点传输H2S信号分子对血流动力学和呼吸无影响,可能避免H2S全身毒副作用,是一种减轻心肌缺血再灌注损伤的有前景的治疗方法。
【关键词】：硫化氢 心肌缺血再灌注损伤 微泡 超声
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R542.2
【目录】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-17
• 前言17-27
• 方法27-41
• 结果41-55
• 讨论55-60
• 总结60-61
• 参考文献61-71
• 缩略词表71-73
• 硕士研究生期间发表的文章73-74
• 致谢74-75

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