在体外模拟冠状动脉痉挛微环境下下调Caveolin-1对人脐静脉内皮细胞分泌NO和ET-1的影响

发布时间：2017-09-11 07:27

  本文关键词：在体外模拟冠状动脉痉挛微环境下下调Caveolin-1对人脐静脉内皮细胞分泌NO和ET-1的影响

  更多相关文章： Caveolin-1 一氧化氮 内皮素-1 脂多糖 乙酰胆碱 冠状动脉痉挛

【摘要】：目的通过体外细胞实验研究在致内皮损伤脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)及致冠状动脉痉挛物质乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)微环境中下调Caveolin-1(Cav-1)的表达对人脐静脉内皮细胞(primary human umbilical vein endothelial cell,HUVECs)分泌一氧化氮(nitric oxide,NO)及内皮素-1(endothelin-1,ET-1)的影响,初步探索通过下调Cav-1的表达能否促进NO的产生,降低ET-1的分泌,从而在一定程度上缓解或者抑制冠状动脉痉挛(CAS)的发生。方法人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的培养及鉴定。将原代人脐静脉内皮细胞接种于ECM完全培养基(5%胎牛血清,1%内皮细胞生长因子,1%的青霉素/链霉素抗生素),37°C含5%CO2的温箱培养。倒置显微镜观察内皮细胞生长情况,免疫荧光法鉴定内皮细胞的Ⅷ因子相关抗原。选择3对小干扰RNA(si RNA)序列下调Cav-1的表达,Western-blot印迹法检测Cav-1蛋白表达水平的变化。脂多糖(LPS)构建内皮功能损伤模型:分别用不同浓度(0、10、25、50、75、100μg/m L)LPS体外诱导阴性转染组(HUVECs/si-NC)和Cav-1表达下调组(HUVECs/si Cav-1),CCK8(cell counting kit-8)法观察LPS对HUVECs活性的影响。WST-1(一种高度水溶性四唑盐)法测定检测细胞上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dimutase,SOD)的抑制率。采用Ach刺激内皮细胞构建冠脉痉挛微环境模型:根据前期实验结果,选用75μg/m L的LPS干预内皮细胞24h构建内皮损伤模型,以此细胞模型为基础用10μmol/L乙酰胆碱(Ach)模拟冠脉痉挛微环境:以Ca2+荧光指示剂Fluo4-AM为探针,倒置荧光显微镜检测细胞内钙离子水平([Ca2+]i)的变化评价模型的构建。实验分组:取3-5代的HUVECs进行实验。将等量细胞数接种生长24h后分别加入0、75μg/m L LPS作用24h,更换为含有Ach的孵育液培养,分别取上清检测NO和ET-1的含量。测定NO和ET-1含量,实验分为8组:(1)HUVECs/si-NC;(2)HUVECs/si-NC+LPS;(3)HUVECs/si-NC+Ach;(4)HUVECs/si-NC+LPS+Ach;(5)HUVECs/si Cav-1;(6)HUVECs/si Cav-1+LPS;(7)HUVECs/si Cav-1+Ach;(8)HUVECs/si Cav-1+LPS+Ach.硝酸还原酶法测定上述各组细胞上清NO含量,酶联免疫吸附法(ELISA)测定上述各组细胞上清ET-1含量。结果倒置显微镜和免疫荧光结果显示,在倒置显微镜下观察单个细胞呈典型的铺路石样生长,成团的细胞呈鱼贯样或漩涡状生长。倒置荧光显微镜下观察,DAPI荧光染料着色细胞核呈蓝色,胞浆内有绿色荧光颗粒,Ⅷ因子表达阳性。Western blot印迹结果显示,si RNA干扰后Cav-1蛋白表达水平均下降,尤以si Cav-1(2)下调最明显。LPS作用24小时诱导内皮损伤呈剂量依赖性,LPS浓度在75μg/m L时HUVECs/si-NC和HUVECs/si Cav-1分别与空白对照组相比细胞存活率明显降低(P0.05),并且在75μg/m L时HUVECs/si-NC和HUVECs/si Cav-1分别与空白对照组相比SOD抑制率下降,有统计学差异(P0.05),间接反映内皮细胞损伤模型构建成功。Ach刺激未受损伤的HUVECs/si-NC,[Ca2+]i明显增加而Ach刺激LPS损伤的HUVECs/si-NC,[Ca2+]i水平变化很小甚至不明显,说明冠脉痉挛微环境模拟成功。在Ach刺激下,受损伤的HUVECs/si Cav-1产生的NO较受损伤的HUVECs/si-NC多(P0.05),二者有明显的统计学差异。Ach刺激受损伤的HUVECs/si Cav-1和受损伤的HUVECs/si-NC,二者ET-1的含量无统计学差异。结论在LPS和Ach共同模拟的冠脉痉挛微环境下,下调Cav-1的表达能够促进HUVECs对NO的分泌,但对ET-1的分泌无影响,本研究为冠脉痉挛的预防和治疗提供了新靶点。
【关键词】：Caveolin-1 一氧化氮 内皮素-1 脂多糖 乙酰胆碱 冠状动脉痉挛
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R543.3
【目录】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-12
• 材料和方法12-24
• 一．实验材料12-16
• 二．实验方法16-24
• 实验结果24-32
• 1. 原代人脐静脉内皮细胞的形态学和免疫荧光学鉴定24
• 2. si Cav-1(2)明显降低 Cav-1 的蛋白表达水平24-25
• 3. 75μg/ml 脂多糖能显著降低 HUVECs/si-NC 和 HUVECs/si Cav-1 细胞活性25-26
• 4. 75μg/m L 脂多糖明显降低 HUVECs/si-NC 和 HUVECs/si Cav-1 细胞 SOD 抑制率26-27
• 5. 受损伤和未受损伤的HUVECs/si-NC细胞内钙离子([Ca2+]i)对Ach的反应27-29
• 6. Ach 刺激损伤细胞时，Cav-1 下调能促进NO的释放29-30
• 7. Ach 刺激损伤内皮细胞时，，ET-1 的含量无明显改变30-32
• 讨论32-34
• 结论34-35
• 参考文献35-40
• 综述40-49
• 参考文献44-49
• 硕士期间文章发表情况49-50
• 致谢50-52
• 个人简历52-53

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本文编号：829399