榄香烯抗再狭窄的机理研究及其缓释涂层的检测

发布时间：2017-09-18 06:23

  本文关键词：榄香烯抗再狭窄的机理研究及其缓释涂层的检测

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【摘要】：经皮冠状动脉介入治疗是现在治疗冠状动脉粥样硬化性心血管疾病的主要方法之一,但其术后3-6个月内高达30%~50%的再狭窄发生率,使再狭窄的机理和防治研究成为该领域的焦点。近年,广泛使用的雷帕霉素和紫杉醇药物洗脱支架已经使再狭窄率降低至10%以下,可是仍存在内皮化延迟、晚期血栓等副作用,所以研发新型、毒副作用小、经济、高效的支架涂层药物尤为重要。再狭窄是多种因素综合作用的结果,包括血管内膜损伤,血管平滑肌细胞迁移及增殖,血栓形成,血管重塑等一系列病理过程,其中,血管平滑肌细胞过度增殖、迁移分泌大量的胞外基质等异常的生物学表现是导致再狭窄发生的主要原因。榄香烯是中国自主研发的非细胞毒性抗肿瘤药物,提取自中草药姜科植物温郁金,具有高效广谱抑制肿瘤细胞生长的作用。前期研究显示榄香烯可以抑制平滑肌细胞迁移和增殖,同时又能抑制血小板的聚集,扩张血管,改善血循环,具有应用于心血管系统,防治再狭窄的前景。脂质体具有长期缓释、主动靶向、高效持续治疗等优点,所以制备榄香烯脂质体有可能成为新型、高效的抗再狭窄支架涂层药物。本文主要研究内容及结果如下:①榄香烯对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响。分离和培养大鼠主动脉原代血管平滑肌细胞;通过细胞计数法研究榄香烯对血管平滑肌细胞增殖的影响;划痕法和小室法研究榄香烯对细胞迁移的影响。结果显示,当榄香烯浓度超过12.5μg/ml时,显著抑制血管平滑肌细胞的增殖和迁移(P0.05),且作用具有剂量-时间依赖性。随着榄香烯浓度的增加,处理原代血管平滑肌细胞后,细胞铺展面积减小、胞间连接被打断、核质皱缩,形态狭长。②榄香烯对血管平滑肌细胞增殖和迁移的机理研究。流式细胞术检测榄香烯对细胞周期和凋亡的影响;免疫荧光检测榄香烯对细胞骨架F-actin和胞内Ca2+的影响;采用FX-4000T细胞张应变加载系统,对血管平滑肌细胞施加5%牵张幅度的周期性张应变,加载频率为1.0Hz,时间为12h,Inc RNA芯片分析榄香烯对平滑肌细胞增殖相关基因的表达,WB检测加载前后PCNA、P53、Cx43蛋白的量。结果显示,榄香烯能够阻滞细胞于S/G2期,并能促进细胞凋亡,且作用具有剂量-时间依赖性。25μg/ml的榄香烯作用血管平滑肌细胞与对照组比较,细胞排列紊乱、稀疏,形态狭长,且细胞骨架的肌丝变粗、荧光增强。25μg/ml的榄香烯作用血管平滑肌细胞后,平滑肌细胞内游离Ca2+浓度先明显升高1倍再恢复到正常水平。力学加载后,与对照组比较,榄香烯处理组血管平滑肌细胞的基因表达谱中相对无药物处理组有1417个基因表达差异在2倍以上,涉及PPAR、MAPK、Akt、Erk1/2等约34个信号通路,其中P53的表达增加,PCNA和Cx43的表达下降。③榄香烯脂质体缓释涂层的制备及其对血管平滑肌细胞增殖的影响。用乙醇注入法制备榄香烯脂质体;静电电喷制备榄香烯脂质体涂层;液相色谱检测榄香烯脂质体涂层的缓释效果;药物缓释涂层与血管平滑肌细胞共培养,分析对其增殖和周期的影响。实验制备的榄香烯脂质体大小均匀,呈卵圆形。结果表明,在1h、36h、7d、28d时,榄香烯脂质体电喷涂层和榄香烯注射液涂层比较,具有显著的缓释效果(P0.05)。10μg/mm2、15μg/mm2的榄香烯药物电喷膜与对照组相比较,对VSMC的增殖有明显的抑制作用(P0.05),且阻滞细胞分裂周期于S期和G2期。综上,榄香烯可以抑制平滑肌细胞的增殖、迁移,阻滞周期,促进凋亡,其作用涉及多种蛋白因子及信号通路。榄香烯脂质体具有缓释效果和抑制平滑肌细胞增殖的作用。本研究为榄香烯作为支架涂层药物在经皮冠脉介入治疗领域的应用提供了一定的实验依据。
【关键词】：榄香烯 血管平滑肌细胞 增殖 脂质体
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-7
• 主要缩略词表7-11
• 1 绪论11-20
• 1.1 问题的提出及研究的意义11-12
• 1.1.1 问题的提出11-12
• 1.1.2 研究的意义12
• 1.2 国内外研究现状12-17
• 1.2.1 再狭窄机制的研究现状12-14
• 1.2.2 抗再狭窄药物的研究现状14-15
• 1.2.3 榄香烯药物的药理研究和应用研究现状15-16
• 1.2.4 脂质体的研究现状及其在生物医药中的应用16-17
• 1.3 研究的目的、内容及技术路线17-20
• 1.3.1 研究目的17-18
• 1.3.2 研究内容18
• 1.3.3 创新点18-19
• 1.3.4 技术路线19-20
• 2 榄香烯对血管平滑肌细胞增殖和迁移的影响20-32
• 2.1 引言20
• 2.2 材料、试剂与仪器20-21
• 2.2.1 实验材料20
• 2.2.2 实验试剂20-21
• 2.2.3 实验仪器21
• 2.3 实验方案21-23
• 2.3.1 SD大鼠主动脉血管平滑肌细胞的原代培养和传代培养21-22
• 2.3.2 原代血管平滑肌细胞的 α-SMA免疫荧光染色22
• 2.3.3 原代血管平滑肌细胞生长曲线的测定22
• 2.3.4 细胞计数法研究榄香烯对血管平滑肌细胞增殖的影响22
• 2.3.5 划痕法研究榄香烯对血管平滑肌细胞迁移的影响22-23
• 2.3.6 Transwell法研究榄香烯对 100%FBS诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响23
• 2.3.7 统计学处理23
• 2.4 实验结果23-30
• 2.4.1 原代血管平滑肌细胞的形态学观察23-24
• 2.4.2 原代血管平滑肌细胞的 α-SMA免疫荧光染色24
• 2.4.3 原代血管平滑肌细胞生长曲线的测定24-25
• 2.4.4 榄香烯对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用25-27
• 2.4.5 划痕法分析榄香烯对血管平滑肌细胞迁移的抑制作用27-29
• 2.4.6 Transwell法研究榄香烯对 100%FBS诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响29-30
• 2.5 小结30-32
• 3 榄香烯抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移的机理研究32-48
• 3.1 引言32
• 3.2 材料、试剂与仪器32-34
• 3.2.1 实验材料32-33
• 3.2.2 实验试剂33
• 3.2.3 实验仪器33-34
• 3.3 实验方法34-36
• 3.3.1 流式细胞术研究榄香烯对血管平滑肌细胞周期的影响34
• 3.3.2 流式细胞术研究榄香烯对血管平滑肌细胞凋亡的影响34
• 3.3.3 榄香烯对血管平滑肌细胞F-actin的影响34-35
• 3.3.4 激光共聚焦显微镜研究榄香烯对血管平滑肌细胞Ca2+的影响35
• 3.3.5 IncRNA芯片研究力学拉伸后榄香烯对血管平滑肌细胞增殖的影响35
• 3.3.6 Weston bolt研究力学拉伸后榄香烯对血管平滑肌细胞内PCNA、Cx43、P53 表达情况35-36
• 3.3.7 统计学处理36
• 3.4 实验结果36-46
• 3.4.1 榄香烯对血管平滑肌细胞周期的影响36-38
• 3.4.2 榄香烯对血管平滑肌细胞凋亡的影响38-42
• 3.4.3 榄香烯对血管平滑肌细胞内F-actin的影响42
• 3.4.4 榄香烯对血管平滑肌细胞内Ca2+水平的影响42-43
• 3.4.5 IncRNA芯片研究力学拉伸后榄香烯对血管平滑肌细胞增殖的影响43-44
• 3.4.6 Western blot研究力学拉伸后榄香烯对血管平滑肌细胞内PCNA、Cx43、P53 表达的影响44-46
• 3.5 小结46-48
• 4 榄香烯脂质体涂层的制备及对血管平滑肌细胞增殖的影响48-60
• 4.1 引言48
• 4.2 材料、试剂与仪器48-49
• 4.2.1 实验材料48
• 4.2.2 实验试剂48-49
• 4.2.3 实验仪器49
• 4.3 实验方法49-51
• 4.3.1 榄香烯脂质体的制备49-50
• 4.3.2 静电电喷制备榄香烯脂质体涂层50
• 4.3.3 榄香烯脂质体涂层药物释放率检测50-51
• 4.3.4 榄香烯脂质体涂层对血管平滑肌细胞增殖的影响51
• 4.3.5 榄香烯脂质体涂层对血管平滑肌细胞周期的影响51
• 4.3.6 统计学处理51
• 4.4 实验结果51-58
• 4.4.1 扫描电镜观察榄香烯脂质体涂层51-52
• 4.4.2 榄香烯脂质体涂层的药物释放率52-54
• 4.4.3 榄香烯脂质体涂层对血管平滑肌细胞生物学形态的影响54-55
• 4.4.4 榄香烯脂质体涂层对血管平滑肌细胞增殖的影响55-56
• 4.4.5 榄香烯脂质体涂层对血管平滑肌细胞周期的影响56-58
• 4.5 小结58-60
• 5 结论和展望60-63
• 5.1 主要结论60-62
• 5.2 存在的不足和后续工作建议62-63
• 致谢63-64
• 参考文献64-68
• 附录68
• A. 作者在攻读学位期间发表的论文：68
• B. 作者在攻读硕士学位期间曾参与的科研项目：68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 李巍;黄岚;;PCI术后再狭窄的病理生理及其危险因素[J];中国动脉硬化杂志;2013年04期

2 戴敬;吕树铮;宋现涛;柳弘;田锐;陈欣;葛长江;周渊;苑飞;;支架再狭窄的机制及防治新进展[J];中华老年心脑血管病杂志;2014年03期

3 张文高,邵念方,管昌益,周苏宁,崔连群,马学盛,江巍;中医药防治经皮腔内冠状动脉成形术后再狭窄的现状和思路[J];山东中医药大学学报;2000年01期

4 周蕾;;榄香烯联合紫杉醇脂质体加顺铂化疗治疗非小细胞肺癌的疗效分析[J];中国肿瘤临床;2010年07期

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本文编号：873900