溶酶体酸性alpha-葡糖苷酶在冠心病发病中的作用探讨

发布时间：2017-09-19 07:34

  本文关键词：溶酶体酸性alpha-葡糖苷酶在冠心病发病中的作用探讨

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【摘要】：研究背景：冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary artery disease,CAD)是一种由遗传因素和环境因素互相作用导致的常见的复杂性疾病,是目前人群死亡的主要原因之一,但目前引起其发生的遗传原因尚不明确。自噬是一个利用细胞内的溶酶体分解蛋白质及自身细胞器并将其产生的部分物质予以回收利用的高度保守的细胞降解过程。近年来研究认为自噬参与脂质代谢过程及炎症反应等从而影响冠心病的发生、发展。研究已经表明,在冠心病患者中自噬基因的表达有所改变,发生了自噬功能失调。目的：研究溶酶体酸性水解酶α-葡萄糖苷酶(GAA)基因在冠状动脉粥样硬化性心脏病患者和健康对照组中的表达水平,探讨溶酶体酸性水解酶在冠状动脉粥样硬化性心脏病的发生、发展方面的作用及其机制,为冠心病的诊疗和研究提供新的理论依据。方法：采集248例冠心病患者和208例健康对照(年龄、性别相匹配)的外周空腹静脉血,并分离外周血白细胞和血浆。采用高敏感性荧光原底物法测定α葡糖苷酶的活性,以不同浓度梯度的4-甲基伞酮纯品制作标准曲线,使用Turner Biosystems TBS-380微型荧光计测定荧光强度,使用SPSS统计软件线性回归产生的方程式计算酶活性。采用RT-PCR方法分析GAA的相对转录水平：使用总RNA提取试剂TRIzol reagent提取白细胞总RNA,使用逆转录试剂盒逆转录合成cDNA,然后PCR扩增GAA基因(30循环)和β- actin基因(25循环)片段。实验结束后,PCR产物经琼脂糖电泳并成像。用灰度扫描定量,GAA的信号强度用β- actin标准化。所有的实验均重复三次,取结果的平均值进行分析。采用Western blot的方法检测GAA的蛋白水平：用细胞裂解液裂解白细胞提取蛋白质,用核酸蛋白测定仪测定所得蛋白溶液的浓度。取30μg蛋白使用蛋白分离胶进行SDS-PAGE,然后将之转印到硝酸纤维素膜；然后硝酸纤维素膜与GAA抗体或β- actin抗体孵育,然后再与HRP标记的第二抗体孵育,最后用化学发光试剂盒进行显像成像。所有的实验均重复三次,取结果的平均值进行分析。蛋白的信号数据分析方法同RT-PCR实验。最后从GAA的酶学活性、蛋白质翻译水平和基因转录水平上来分析GAA基因表达情况,并结合患者的临床化验指标,在冠心病患者组和健康对照组之间进行其表达差异的比较。结果：GAA的酶活性在冠心病组较对照组显著升高,其差别有统计学意义(P0.05),但在冠心病不同的类型之间(稳定性心绞痛、不稳定性心绞痛和心肌梗塞)没有明显的差别。在转录水平上,冠心病组的GAA的转录水平较对照组显著升高(P0.01),但是在冠心病各个分组中其差别无统计学意义(P0.05)。其结果与GAA酶活性的变化相一致。多因素Logistic回归分析显示,GAA基因的转录水平与冠心病的发病密切相关(OR 5.93,95% CI 2.98-11.78, P= 3.89×10-7)。GAA的蛋白质翻译水平采用Western blot方法进行了检测。CAD病人的GAA蛋白水平较对照升高(图3A,3B),但是其差别无统计学意义(P0.05)。而且,在冠心病的三个类型之间也没用明显的差别,这可能是与Western blot敏感性有关。结论：与正常对照组相比,GAA基因的表达水平在冠心病患者外周血白细胞中发生了改变。多因素Logistic回归分析显示GAA表达水平的改变与冠心病之间存在着密切的联系。我们的研究结果表明,GAA基因可能在冠心病的发生和发展过程中发挥着重要的作用。
【关键词】：冠心病 心肌梗死 自噬 溶酶体 酸性α-葡糖苷酶
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R541.4
【目录】：

• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-13
• 1 材料与方法13-31
• 2 实验结果31-35
• 3 讨论35-38
• 4 小结38-39
• 参考文献39-43
• 综述43-53
• 参考文献50-53
• 附录53-54
• 攻读学位期间发表文章情况54-55
• 致谢55-56
• 个人简历56

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本文编号：880369