SOCS1介导AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖的作用及机制

发布时间：2017-09-21 05:20

  本文关键词：SOCS1介导AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖的作用及机制

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【摘要】：目的:探讨细胞因子信号转导抑制因子-1(suppressor of cytokine signal1ing-1,SOCS1)对血管紧张素II(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)增殖的影响及可能的机制。方法:1)以人脐动脉血管平滑肌细胞(VSMC)为研究对象,建立AngⅡ促VSMC增殖模型。用0mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L等不同终浓度的AngⅡ孵育细胞48h,行MTT检测,得出作用最明显的浓度,以该浓度AngⅡ孵育细胞0h、12h、24h、48h、72h,行MTT检测,得出最佳作用时间。2)最佳作用浓度AngⅡ分别刺激VSMC 0h、12h、24h、48h、72h,DCFH-DA探针检测活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平,Western-blot检测SOCS1表达情况。3)设计与合成3对靶向人SOCS1基因的si RNA(SOCS1-si RNA),实时荧光定量-PCR和Western-blot筛选最佳SOCS1-si RNA。4)用阳离子脂质体将最佳SOCS1-si RNA转染VSMC,给予AngⅡ孵育。实验作2个分组:实验1:空白对照组、SOCS1-si RNA组、AngⅡ组、AngⅡ+SOCS1-si RNA组、Ly294002组、Ly294002+AngⅡ组;(Ly294002为Akt信号通路阻断剂)实验2:空白对照组、SOCS1-si RNA组、天然维生素E组、AngⅡ组、AngⅡ+SOCS1-si RNA组、、天然维生素E+AngⅡ组。(天然维生素E为ROS清除剂)5)用MTT比色法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞凋亡率,DCFH-DA探针法检测细胞内活性氧(ROS)水平,Western-blot技术分别测定SOCS1、凋亡相关基因Bax和Bcl-2、Akt信号通路蛋白总Akt、p-Akt的表达。6)数据以均数±标准差(sx±)表示,用SPSS 17.0软件分析数据,P0.05认为差异有统计学意义。结果:1)10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的AngⅡ均可促进VSMC增殖,其中10-7mol/L浓度的AngⅡ作用最明显;用10-7mol/L的AngⅡ刺激VSMC0h、12h、24h、48h、72h,其促增殖的作用在48h内表现为时间依赖性,刺激72h时的其促增殖作用与48h无明显差异。选取10-7mol/L的AngⅡ刺激VSMC48h用于后续实验。2)AngⅡ促进VSMC内ROS生成及SOCS1表达。3)成功设计并筛选出一对能够有效沉默SOCS1表达的SOCS1-si RNA3。4)与空白对照组相比,AngⅡ组细胞增殖率明显增加(P0.01),SOCS1-si RNA、Ly294002组VSMC增殖率下降(P0.01),凋亡率明显上升(P0.05);SOCS1-si RNA、Ly294002对VSMC生存的影响效果相似(P0.05);SOCS1-si RNA+AngⅡ组、Ly294002+AngⅡ组细胞增殖率与AngⅡ组相比明显下降(P0.01),凋亡率与空白对照组相比无明显差异(P0.05),两者之间的存活率相比较无统计学差异(P0.05)。5)与空白对照组相比,SOCS1-si RNA组的SOCS1蛋白的表达明显降低(P0.01)、Bax/Bcl2比值增大(P0.01),AngⅡ组Bax/Bcl2比值减小(P0.05);与AngⅡ组相比,SOCS1-si RNA+AngⅡ组的SOCS1蛋白表达减少(P0.01)、Bax/Bcl2比值增大(P0.01);与空白对照组相比,Ly294002组SOCS1蛋白表达差异无统计学意义(P0.05),而Bax/Bcl2比值增大(P0.01);与Ly294002组相比,Ly294002+AngⅡ组的Bax/Bcl2比值明显减小(P0.01)。6)各个实验组的总Akt蛋白表达差异无统计学意义(P0.05);与空白对照组相比,AngⅡ组p-Akt蛋白表达增加(P0.05)、SOCS1-si RNA组、Ly294002组p-Akt表达明显下降(P0.01),并且后两者p-Akt蛋白无明显差异(P0.05);与AngⅡ组相比,SOCS1-si RNA+AngⅡ组、Ly294002+AngⅡ组p-Akt表达减少(p0.05),且这两组相互之间的p-Akt蛋白的差异无统计学意义(P0.05)。7)与空白对照组相比,SOCS1-si RNA组平均荧光强度(mean fluorescence intensity,MFI)减低(P0.05)、细胞增殖率下降(P0.05)、凋亡率上升(P0.01),AngⅡ组MFI明显增强(P0.01)、增殖率明显增加(P0.01),凋亡率无明显变化(P0.05),天然维生素E组MFI、增殖率、凋亡率变化无统计学意义(P0.05);与AngⅡ组相比,SOCS1-si RNA+AngⅡ组、天然维生素E+AngⅡ组的MFI明显降低(P0.01),增殖率下降(P0.01),凋亡率变化无统计学意义(P0.05)。结论:1)RNA干扰可以有效的抑制SOCS1在脐动脉血管平滑肌细胞中的表达。2)SOCS1表达下调可以有效地抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖,SOCS1介导了AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖的作用。3)SOCS1介导AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖的作用与细胞内Bax/Bcl2比值变化有关。4)Akt信号通路和ROS可能参与了SOCS1介导的AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖。
【关键词】：血管平滑肌细胞 SOCS1 血管紧张素II
【学位授予单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R543.5
【目录】：

• 摘要3-6
• ABSTRACT6-11
• 第1章 引言11-13
• 第2章 材料与方法13-31
• 2.1 材料13-19
• 2.1.1 细胞株13
• 2.1.2 购置试剂13-14
• 2.1.3 自配试剂14-17
• 2.1.4 主要仪器设备及耗材17-19
• 2.2 方法19-30
• 2.2.1 细胞培养19-20
• 2.2.2 建立AngⅡ促血管平滑肌细胞增殖模型20-21
• 2.2.3 DCFH-DA探针测定细胞ROS水平21
• 2.2.4 SOCS1-siRNA的设计、合成及筛选21-23
• 2.2.5 血管平滑肌细胞的转染及AngⅡ作用23-24
• 2.2.6 MTT法测定细胞活力24
• 2.2.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率24
• 2.2.8 荧光定量PCR（qPCR）法检测SOCS1的表达24-27
• 2.2.9 Western-blot检测SOCS1、Bax、Bcl2、总Akt、p-Akt（Ser473）蛋白的表达27-30
• 2.2.10 活性氧的检测30
• 2.3.统计学处理30-31
• 第3章 实验结果31-40
• 3.1 脐动脉血管平滑肌细胞形态31
• 3.2 AngⅡ对血管平滑肌细胞增殖影响31-32
• 3.3 AngⅡ对血管平滑肌细胞内ROS水平、SOCS1表达的影响32-33
• 3.4 SOCS1-siRNA的筛选33-35
• 3.4.1 转染条件的优化33
• 3.4.2 qPCR法和Western-blot分析3对SOCS1-siRNA序列对SOCS1基因表达的抑制作用33-35
• 3.5 SOCS1-siRNA对VSMC存活率和凋亡率的影响35-36
• 3.6 AngⅡ、SOCS1-si RNA及Ly294002对凋亡相关基因表达的影响36
• 3.7 SOCS1-siRNA对Akt信号通路的影响36-38
• 3.8 ROS对SOCS1-siRNA抑制AngⅡ诱导的VSMC增殖的影响38-40
• 3.8.1 SOCS1-siRNA对AngⅡ诱导的ROS生成的影响38
• 3.8.2 ROS的变化对VSMC存活率及凋亡的影响38-40
• 第4章 讨论40-44
• 第5章 结论与展望44-45
• 5.1 结论44
• 5.2 进一步工作的方向44-45
• 致谢45-46
• 参考文献46-48
• 攻读学位期间的研究成果48-49
• 综述49-56
• 参考文献54-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 Ning Shi;Shi-You Chen;;Mechanisms simultaneously regulate smooth muscle proliferation and differentiation[J];The Journal of Biomedical Research;2014年01期

2 孟蕾;;超声在颈动脉粥样硬化斑块稳定性判断中的应用[J];山东医药;2013年48期

3 李平;高思海;揭伟;敖启林;黄亚非;;Astilbin Inhibits Proliferation of Rat Aortic Smooth Muscle Cells Induced by Angiotensin Ⅱ and Down-regulates Expression of Protooncogene[J];Journal of Huazhong University of Science and Technology(Medical Sciences);2012年02期

4 陈旭;齐凤坤;康立功;李景富;;实时荧光定量PCR技术研究进展及其应用[J];东北农业大学学报;2010年08期

5 杨海平;戴敏;张东华;;细胞因子信号传导抑制蛋白-1(SOCS-1)研究进展[J];中国实验血液学杂志;2007年02期

6 彭宁;刘俊田;;血管紧张素Ⅱ诱导活性氧簇的产生及其在血管损伤的信号机制[J];生理科学进展;2006年04期

7 魏秀青,余平,黎明;细胞因子信号转导抑制分子的研究进展[J];国外医学(生理、病理科学与临床分册);2005年01期

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本文编号：892607