wnt5b诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

发布时间：2017-09-22 10:34

  本文关键词：wnt5b诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究

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【摘要】：目的:心肌梗死的致残致死率极高,已成为危及生命的重大疾病,现有的治疗手段难以从根本上解决问题;干细胞治疗心肌梗死的前景相当广阔,但仍存在诸多问题,例如:移植后干细胞分化率较低、存活率低等。本研究拟通过调节wnt5b基因的表达,探讨BMSCs向心肌样细胞分化率的改变,旨在为临床心肌梗死的治疗提供更有效的方法。方法:选取4周龄SD大鼠胫骨提取骨髓间充质干细胞,利用贴壁法培养,传代生长到P3代,以流式细胞仪检测细胞表面抗原,主要选用CD29、CD 44、CD 34、CD 45鉴定骨髓间充质干细胞。选取生长良好的P3代骨髓间充质干细胞分为四个实验组,分别转染si RNA-空白对照(si RNA-NC)、wnt5b基因沉默组(si RNA-wnt5b)、PEX1-空白对照(PEX1-NC)、wnt5b基因高表达组(PEX1-wnt5b),从而实现对wnt5b基因沉默及高表达,24h后向每组细胞内加入心肌细胞裂解液诱导分化。在体外,于3天、7天、14天收取细胞,以q PCR检测各组细胞心肌特异性因子Nkx2.5、GATA-4、CX43、Myo D的m RNA量;以免疫荧光检测各组细胞中的特异性CX43、Desmin表达,比较各组荧光亮度;以蛋白印迹法(western blot,WB)检测各组细胞Desmin、c Tn T蛋白表达量,比较各组特异蛋白表达的变化。在体内,建立大鼠心梗模型,48h后注射四组处理后的细胞,分别于术后第1、28天心超检测大鼠心功能指标,28天后取出心脏行HE染色,Masson染色,免疫荧光等检测心肌分化指标。结果:贴壁法分离得到P3代BMSCs,镜下观察细胞长条状,呈极性生长,流式鉴定细胞表面抗原CD29、CD 44阳性,CD 34、CD 45阴性。处理后3天q PCR检测心肌特异性因子,si RNA-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4表达量升高,而PEX1-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4表达受到抑制,与对应的阴性对照组相比有统计学差异;si RNA-wnt5b组CX43、Myo D表达量下降,而PEX1-wnt5b组CX43、Myo D表达略升高,与对应的阴性对照组相比无统计学差异。处理后7天、14天q PCR检测心肌特异性因子,si RNA-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4、CX43、Myo D表达量升高,而PEX1-wnt5b组Nkx2.5、GATA-4、CX43、Myo D表达受到抑制,与对应的阴性对照组相比有统计学差异。体外免疫荧光检测心肌特异性蛋白CX43、Desmin,western blot检测Desmin、c Tn T蛋白表达,si RNA-wnt5b组表达增高,PEX1-wnt5b组表达降低。建立心梗模型,向梗死心肌表面注射处理后的BMSCs,转染si RNA-wnt5b组大鼠心功能较转染PEX1-wnt5b组明显修复;Masson染色分析心梗面积发现:si RNA-wnt5b组梗死纤维组织面积最小,而PEX1-wnt5b组梗死纤维组织面积最大,与相应的阴性对照组比较有统计学差异;HE染色可见si RNA-wnt5b组较PEX1-wnt5b组心肌细胞排列整齐,炎症细胞浸润减少;最后对注射BMSCS的心脏组织进行免疫荧光检测,CX43在si RNA-wnt5b组表达增高,而PEX1-wnt5b组表达降低。结论:wnt5b在BMSCs向心肌样细胞分化中有重要的调控作用,上调wnt5b抑制BMSCs向心肌样细胞分化,下调wnt5b则促进其分化;wnt5b可能是通过改变GSK-3β的表达,调控BMSCs向心肌样细胞分化。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 分化 心肌样细胞 wnt5b
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R542.22
【目录】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-13
• 第一部分 SD大鼠骨髓间充质干细胞及心肌细胞培养13-17
• 一、材料13-14
• 二、方法14-15
• 三、结果15-17
• 第二部分 wnt5b过表达质粒构建17-23
• 一、材料17-18
• 二、方法18-20
• 三、结果20-23
• 第三部分 wnt5b影响大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的体外研究23-39
• 第一节 转染wnt5b过表达质粒及wnt5b-siRNA检测心肌特异性因子表达23-30
• 一、材料23
• 二、方法23-27
• 三、结果27-30
• 第二节 心肌特异性因子的免疫荧光检测30-35
• 一、材料30-31
• 二、方法31
• 三、结果31-35
• 第三节 Western-blot法检测心肌特异性蛋白的表达35-39
• 一、材料35
• 二、方法35-37
• 三、结果37-39
• 第四部分 wnt5b影响大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的体内研究39-48
• 一、材料39-40
• 二、方法40-42
• 三、结果42-48
• 讨论48-53
• 结论53-54
• 参考文献54-60
• Review60-84
• 参考文献72-84
• 英汉双解缩略词表84-85
• 攻读学位期间发表的论文85-86
• 致谢86-88

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前5条

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本文编号：900331