重组组织型纤溶酶原激活剂-RGDS肽融合蛋白的表达、纯化及鉴定

发布时间：2017-09-26 20:01

  本文关键词：重组组织型纤溶酶原激活剂-RGDS肽融合蛋白的表达、纯化及鉴定

  更多相关文章： 重组组织型纤溶酶原激活剂 RGDS 原核表达 自诱导 靶向性

【摘要】：目的 人组织纤溶酶原激活剂(tPA)属于丝氨酸蛋白酶家族。它能将纤溶酶原转换成纤溶酶,在临床用于血栓性疾病的治疗。通过原核表达和纯化重组组织型纤溶酶原激活剂(tPA)-RGDS肽融合蛋白,并初步鉴定其生物学活性,为靶向性研究奠定基础。方法 1)设计引物利用聚合酶链式反应(PCR)方法使基因重组获得目的基因片段tPA-RGDS,插入带有His标签的高效可溶性表达载体pQE30中,构建重组表达质粒pQE30-tPA-RGDS;将重组表达质粒转化至大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli) BL21,经自诱导方法诱导目的基因表达；对融合蛋白His-tPA-RGDS用Ni-NTA亲和层析柱纯化；最后用纤维蛋白平板法评价其生物活性。2)利用PCR方法使基因重组获得目的基因片段3C-tPA-RGDS,优化原核表达条件(表达载体、表达菌、诱导温度),插入带有His标签的原核高效可溶性表达载体pW28中,构建重组表达质粒pW28-3C-tPA-RGDS,将重组表达质粒转化至大肠杆菌Origami 2,经自诱导方法诱导目的基因表达；对融合蛋白His-3C-tPA-RGDS用Ni-NTA亲和层析柱和DEAE阴离子交换层析柱纯化,再用PreScission蛋白酶切3C蛋白从而切除His标签,用分子筛纯化和分析融合蛋白tPA-RGDS聚集状态,以SDS-PAGE分析其表达量和纯度,用Western blot鉴定tPA-RGDS,最后用纤维蛋白平板法评价其生物活性。结果构建重组表达质粒pQE30-tPA-RGDS和pW28-3C-tPA-RGDS经PCR、双酶切鉴定及基因测序证实构建成功；His-tPA-RGDS和His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在大肠杆菌中获得可溶性上清表达；His-3C-tPA-RGDS融合蛋白在原核表达体系(pW28载体、Origami 2菌株及37℃诱导温度)得到了最优的表达；通过PreScission蛋白酶成功去除His标签,得到tPA-RGDS融合蛋白,SDS-PAGE显示其相对分子质量约为70000 Da,分子筛显示其在溶液中以单聚体形式存在；从上清中获得了纯度较高的tPA-RGDS融合蛋白,体外实验显示其纤溶活性为2.5×105IU/mg。结论1)首次使重组组织型纤溶酶原激活剂通过自诱导方法得到可溶性表达,为tPA工业和制药水平发展提供了有价值的信息；2)获得了纯度和活性较高的tPA-RGDS融合蛋白,为下一步进行融合蛋白的靶向性研究奠定了基础。
【关键词】：重组组织型纤溶酶原激活剂 RGDS 原核表达 自诱导 靶向性
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R54
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照5-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-13
• 第一章 His-tPA-RGDS融合蛋白的表达、纯化及鉴定13-22
• 1 材料与方法13-19
• 2 实验结果19-21
• 3 讨论21-22
• 第二章 tPA-RGDS融合蛋白的表达、纯化及功能鉴定22-38
• 第一节 重组表达菌构建、优化及表达22-31
• 1 材料与方法22-26
• 2 实验结果26-30
• 3 讨论30-31
• 第二节 tPA-RGDS融合蛋白的纯化及鉴定31-38
• 1 材料与方法31-34
• 2 实验结果34-36
• 3 讨论36-38
• 全文总结38-39
• 参考文献39-43
• 文献综述43-50
• 参考文献47-50
• 致谢50-51
• 发表的论文、参加的学术会议及参与的科研项目51

【相似文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 张志祥,姚其正;融合蛋白—— 一种新的生物工程技术[J];药物生物技术;2001年01期

2 李大鹏,王莉,卫红飞,张培因,吴秀丽,万敏,王燕媚,王爱丽,杨世杰,王丽颖;热休克蛋白65-MUC1融合蛋白对小鼠干扰素γ产生细胞的诱生作用[J];吉林大学学报(医学版);2004年03期

3 曲梅花;于继云;胡美茹;王守训;黎燕;;人CD28-Fc融合蛋白在真核细胞中的表达与纯化[J];医学分子生物学杂志;2005年05期

4 张荣媛;王静;李茜;王航雁;;融合蛋白技术及临床应用进展[J];国际生物制品学杂志;2006年02期

5 何火聪;刘树滔;潘剑茹;陈躬瑞;饶平凡;;GST-TAT-GFP融合蛋白的表达、纯化及鉴定[J];福建医科大学学报;2006年04期

6 严世荣;闫莹;孙军;宗义强;王小波;屈伸;;TAT-EGFP融合蛋白对小鼠生物膜穿透性的研究[J];药物生物技术;2007年05期

7 马大龙,郭淑君,郑蕾,陈慰峰;在大肠杆菌高效表达人白细胞介素4融合蛋白[J];北京医科大学学报;1990年04期

8 杨和平，黄宗之;融合蛋白的生产技术[J];中国动脉硬化杂志;1994年04期

9 廉德君,许根俊;一种改进的融合蛋白亲和层析纯化方法[J];生物化学与生物物理进展;1998年03期

10 李文平,许静,隋建华,宋增璇;抗人纤维蛋白单链抗体-链亲和素融合蛋白的稳定性及对动物纤维蛋白的识别[J];中国免疫学杂志;1999年09期

中国重要会议论文全文数据库 前10条

1 祝强;黄智华;黄予良;覃扬;;rhEPO-L-Fc融合蛋白的克隆、表达、生物活性分析及初步药代动力学研究[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年

2 高基民;吕建新;;白细胞介素15/链亲和素融合蛋白的制备及活性测定[A];中国遗传学会第八次代表大会暨学术讨论会论文摘要汇编（2004-2008）[C];2008年

3 孙益;葛霁光;;人睫状神经营养因子和可溶性人睫状神经营养因子受体的融合蛋白的表达[A];中国生物医学工程学会第六次会员代表大会暨学术会议论文摘要汇编[C];2004年

4 杨振泉;刘巧泉;于恒秀;潘志明;焦新安;;新城疫病毒融合蛋白在转基因水稻叶片中的表达及其免疫原性[A];中国生物工程学会第四次会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2005年

5 陈丽华;王强;侯万国;;不同链接剂修饰的融合谷胱甘肽活性的研究[A];中国化学会第十二届胶体与界面化学会议论文摘要集[C];2009年

6 王荣智;汪世华;林文雄;;抗体与酶融合技术研究[A];第十届全国杀虫微生物学术研讨会暨全国生物农药与化学生物学研究与产业化会议论文摘要集[C];2006年

7 刘忠华;丁元生;胡忠义;;结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达[A];2007年中国防痨协会全国学术会议论文集[C];2007年

8 祖东;徐春晓;黄国锦;姚立红;陈爱君;朱宏建;刘沐荣;张智清;;TNFRI∶IgGFc融合蛋白基因的构建及其在大肠杆菌中的高效表达[A];首届长三角科技论坛——长三角生物医药发展论坛论文集[C];2004年

9 刘先俊;刘方欣;黎波;周辉云;王琴琴;;胸腺素α1与复合α干扰素融合蛋白的表达及其生物学活性[A];第九届西南三省一市生物化学与分子生物学学术交流会论文集[C];2008年

10 杨燕凌;;酶(蛋白)融合技术研究[A];华东地区农学会学术年会暨福建省科协第七届学术年会农业分会场论文集[C];2007年

中国重要报纸全文数据库 前10条

1 记者 朱敏丽　通讯员 潘越;中国医药城首批融合蛋白试剂出口[N];泰州日报;2010年

2 吴红梅;我省首批融合蛋白试剂出口美国[N];新华日报;2010年

3 金陵;融合蛋白试剂首次出口美国[N];中国医药报;2010年

4 记者 毛黎;美开发出癌症治疗新技术[N];科技日报;2009年

5 常丽君;线粒体融合蛋白2决定细胞生死[N];科技日报;2013年

6 通讯员 沈季 记者 张兆军;抗肿瘤融合蛋白进入临床试验[N];科技日报;2005年

7 记者 张晔　通讯员 刘宁春;一种有效治疗冠心病的融合蛋白发现[N];科技日报;2009年

8 ;吉大抗肿瘤生物工程新药进入临床试验[N];中国高新技术产业导报;2005年

9 毛磊;新型抗流感药物有望面世[N];医药经济报;2003年

10 曹丽君;英研制出新型抗流感药物[N];中国中医药报;2003年

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 刘星;赭曲霉毒素A纳米抗体的免疫学检测性能及分子作用机理研究[D];南昌大学;2015年

2 吴芩;Npu DnaE intein的结构与机理研究和蛋白质双模式成像探针的制备及应用[D];中国科学技术大学;2015年

3 杨晶;三组治疗艾滋病的靶向融合蛋白的基因工程研究[D];中国协和医科大学;2004年

4 侯s，

本文编号：925425