人骨髓间充质干细胞成脂诱导方法的优化及其在探索再生障碍性贫血发病机制中的应用

发布时间：2017-09-30 19:02

  本文关键词：人骨髓间充质干细胞成脂诱导方法的优化及其在探索再生障碍性贫血发病机制中的应用

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【摘要】：背景：间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSC)是一种具有高度自我更新和多向分化潜能的多能干细胞,其来源广泛,骨髓、胎盘、脐血等组织中均可以培养出间充质干细胞。由于MSCs在体外扩增迅速,并且可在特定体外培养条件下分化为成骨细胞,软骨细胞,脂肪细胞等,间充质干细胞已成为组织工程和再生医学中理想的种子细胞。不同来源的间充质干细胞生物学特性不尽相同,因此应用于基础及临床研究时用途有所差异。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)因更易向成脂分化和研究较为深入,成为脂肪组织再生修复的理想材料。在临床工作中,软组织损伤病人常面临着修复的难题,如烧伤病人、HIV患者通常伴有软组织萎缩和面部脂质代谢障碍,严重影响生活质量。在基础研究领域,成脂分化也为研究干细胞分化机制提供了良好的模型。由于研究方向广泛,细胞来源不同,间充质干细胞的成脂诱导方法也各不相同。因而常常导致不同实验结果间不能相互比较,极大的阻碍了成脂的相关研究。同时,目前常用的成脂诱导体系培养周期较长,浪费了大量的时间和物质成本。因此,有必要深入了解不同成脂诱导方法对人骨髓间充质干细胞特性的影响。本研究旨在比较不同成脂培养体系下人骨髓间充质干细胞的成脂特性,并进一步比较不同成脂诱导体系的成脂效率,为优化成脂诱导方法提供实验依据。目的：(1)比较人骨髓间充质干细胞在不同成脂诱导条件下的成脂特性；(2)比较不同成脂诱导方法的诱导效率,优化成脂诱导方法。方法：(1)采用三种不同成脂诱导体系对人骨髓间充质干细胞进行体外成脂诱导。(2)应用Real-time PCR方法检测成脂诱导不同时间点处人骨髓间充质干细胞成脂相关基因PPARγ、FABP-4、adiponectin等的表达情况。(3)采用ELISA方法检测成脂诱导不同时间点处培养上清中adiponectin的分泌量。(4)共聚焦显微镜检测成脂诱导后油红染色情况。(5)应用Western blot方法检测成脂过程中PPARγ,C/EBPβ的表达情况。结果：(1)人骨髓间充质干细胞在不同成脂诱导体系下成脂相关基因的表达水平不同。 DIMR组对PPARγ、FABP-4、adiponectin、C/EBPα、LPL的诱导作用高于其余两组。(2)随成脂诱导进程,三组adiponectin的分泌量均逐渐上升,DIMR组分泌水平均高于其余两组。(3)各成脂诱导方法的成脂效率不同。DIMR组可在成脂诱导早期7-8天即可诱导较多脂滴产生。(4)在成脂诱导早期,DIMI组较其他两组诱导表达更多的PPARy蛋白,但PPARy蛋白表达量并不随成脂时间延长持续增加。在DIMR组中PPAR γ表达量并不随成脂诱导时间逐渐增加。结论：(1)不同成脂诱导体系下,人骨髓间充质干细胞表现出不同的成脂特性。(2)DIMR培养方法有更高的成脂效率,诱导7天即可观察到脂滴形成,可以此作为成脂诱导的观测时间点。(3)在DIMR组中PPARy蛋白表达量不能成为检测成脂诱导效果的良好指标。背景：再生障碍性贫血(aplastic anemia, AA)是由骨髓造血功能衰竭所致的,以全血细胞减少为特征的疾病,其病理机制复杂。大量的实验室和临床数据表明免疫功能异常介导的造血抑制在获得性再障的病理机制中发挥重要作用。然而,很多相关研究也证实,再障患者的骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)存在着明显缺陷和异常,如增殖受抑制,造血支持能力下降,免疫抑制能力降低等,这将使他们更易发生骨髓衰竭。因此,再障患者骨髓间充质干细胞的功能异常将可能会参与其发病。瘦素(Leptin)是一种主要由白色脂肪细胞分泌的生物活性分子。它不仅具有调解能量代谢、免疫等功能,还是一种促炎症因子。leptin可促进T淋巴细胞向Th1方向极化。有研究证实它可以参与一些自身免疫性疾病的发生发展,如类风湿性关节炎,多发性硬化等。在血液系统疾病中研究发现,急性淋巴细胞白血病与急性粒细胞白血病患者骨髓中也高表达瘦素。目前对于瘦素与再障发病的相关性并无研究,因此我们初步探索了瘦素在再障患者骨髓中的含量及与骨髓间充质干细胞的联系。本文通过检测AA患者骨髓浆、骨髓间充质干细胞leptin水平,检测炎症因子对骨髓间充质干细胞leptin表达的影响,探讨AA患者BM-MSCs对疾病发生可能存在的新机制。目的：由于瘦素具有明确的免疫调节功能,通过测定再障患者与正常对照骨髓浆中的含量,推测其与再障发病是否能具有一定的相关性。进一步检测再障患者骨髓间充质干细胞的瘦素表达量水平,探讨骨髓间充质干细胞在再障发病中可能存在的新机制。方法：(1)收集再障及正常人骨髓标本,离心收集骨髓浆,ELISA法检测骨髓浆中瘦素含量；(2)采用贴壁、传代培养的方法从再障患者和正常人骨髓组织中获取相对纯化的骨髓间充质干细胞；(3)流式细胞仪检测培养的BM-MSCs表面标志；(4)定向诱导BM-MSCs向成脂分化,比较再障及正常来源BM-MSCs的分化潜能；(5)Real-time PCR法检测再障及正常来源BM-MSCs中瘦素mRNA表达差异；(6)ELISA法检测再障及正常来源BM-MSCs体外培养上清中瘦素的分泌量；(7)比较炎症因子对成脂诱导过程中BM-MSCs产生瘦素的影响。结果：(1)再障患者骨髓浆中瘦素水平高于正常对照。(2)再障患者来源BM-MSCs在转录水平表达更多瘦素,体外培养上清中分泌的瘦素水平也显著高于对照组。(3)炎症因子可以抑制BM-MSCs向成脂分化,但在长期成脂过程中可促进其分泌更多的瘦素。(4)再障来源BM-MSCs更易向成脂分化。(5)再障患者来源BM-MSCs在转录水平表达更多瘦素受体。结论：(1)再障患者骨髓浆表达更高瘦素水平。(2)再障患者BM-MSCs表达更高瘦素水平,可能是导致骨髓浆中瘦素水平上升的原因。(3)炎症因子可能是导致BM-MSCs分泌更多的瘦素的原因。(4)再障来源BM-MSCs表达更高的瘦素受体水平,可能是导致骨髓脂肪化的一种机制。
【关键词】：人骨髓间充质干细胞 成脂诱导 PPARγ 再生障碍性贫血 瘦素 骨髓间充质干细胞 瘦素受体 炎症因子
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R556.5
【目录】：

• 第一部分 人骨髓间充质干细胞成脂诱导方法的优化4-36
• 摘要4-6
• Abstract6-8
• 前言8-10
• 材料和方法10-20
• 结果20-27
• 讨论27-30
• 结论30-31
• 参考文献31-36
• 第二部分 再障患者来源骨髓间充质干细胞瘦素及其受体的表达36-58
• 摘要36-38
• Abstract38-40
• 前言40-42
• 材料和方法42-45
• 结果45-50
• 讨论50-53
• 结论53-54
• 参考文献54-58
• 附录一 主要实验仪器和试剂58-62
• 附录二 主要溶液的配置62-65
• 附录三 英文缩写和代码65-67
• 附录四 在读期间发表文章、参加会议67-68
• 致谢68-69

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本文编号：949849