GATA4突变p.S335X载体构建及初步功能分析

发布时间：2017-10-04 16:01

  本文关键词：GATA4突变p.S335X载体构建及初步功能分析

  更多相关文章： GATA4基因 突变 载体构建 转染 P19 TUNEL 凋亡

【摘要】：目的：GATA4是参与心脏发育的重要转录因子。我们实验组的前期研究从室间隔缺损(ventricular septal defect, VSD)患者心肌组织中发现一种特殊类型的突变GATA4 (p.S335X),此突变可使终止密码子提前产生,导致GATA4的C末端缺失。本课题构建了GATA4野生型(pcDNA6-GATA4-WT, WT)及(p.S335X)突变型(pcDNA6-GATA4-MU, MU)载体,并在小鼠畸胎瘤细胞P19中验证了转染、初步考察了细胞凋亡的影响及可能相关的分子机制。方法：利用5'端加酶切位点序列的特异性引物对人源GATA4 cDNA进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增,分别通过PCR和overlap-PCR得到GATA4编码全长及覆盖突变点的相关片段,通过琼脂糖电泳并回收片段,进行酶切,连接至载体pcDNA6,构建成GATA4WT及MU载体,应用pcDNA6空载(empty vector, E V)质粒作对照。通过测序明确载体序列,对于小鼠畸胎瘤细胞P19进行WT、MU及EV载体的转染,通过收集转染后P19细胞的RNA和总蛋白,应用qPCR确定转染WT及MU载体的P19细胞有大量的GATA4mRNA表达,Western blot鉴定细胞内有GATA4蛋白表达,明确WT及MU载体构建成功。通过TUNEL确定MU对细胞凋亡的基本功能。通过Western blot来初步探索MU参与的相关凋亡分子通路。结果：1.成功构建GATA4WT及MU载体,并通过酶切鉴定、序列检测、PCR基因鉴定及Westernblot蛋白鉴定。2.初步TUNEL功能分析显示,与转染WT的P19细胞比较,转染MU的P19细胞内可观察到更明显的凋亡。3.通过Western blot发现MU载体在P19中可上调促进凋亡信号Bax,下调抑制凋亡信号Bcl-2,抑制P13K增殖信号通路。结论：1.本课题成功构建了GATA4WT及MU载体；2.在小鼠胚胎细胞P19中,相对于WT, GATA4MU (p.S335X)载体的表达使细胞凋亡增强。3.该突变(p.S335X)参与凋亡通路,可影响经典凋亡通路关键蛋白Caspase-3和Caspase-9的表达,使凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Bim、FoxO3a的表达改变,可能涉及线粒体凋亡途径。
【关键词】：GATA4基因 突变 载体构建 转染 P19 TUNEL 凋亡
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R541.1
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-13
• 材料与方法13-28
• 结果28-35
• 讨论35-40
• 结论40-41
• 参考文献41-55
• 文献综述55-70
• 参考文献63-70
• 中英文缩略词表70-71
• 攻读学位期间发表的论文71-72
• 致谢72

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 ;Mutational screening of affected cardiac tissues and peripheral blood cells identified novel somatic mutations in GATA4 in patients with ventricular septal defect[J];Journal of Biomedical Research;2011年06期

，

本文编号：971525