噪声习服对豚鼠的听力保护及miRNA183在其中的作用

发布时间：2018-10-10 07:50

【摘要】：目的：噪声危害已经成为当今世界各国主要的职业危害之一。噪声习服，即为在相对较低强度的噪声中进行训练，从而使机体逐渐适应的过程，其目的是在机体本身不产生永久性听力阈移(permanentthreshold shift，PTS)的基础上，给予适度的刺激，以获得对随后高强度噪声更大的耐受力，从而起到保护听力的作用。噪声习服作为强噪声暴露的一种可能的保护行为，其发生机制有待进一步研究。近些年随着人类后基因组计划的进一步开展，miRNAs越来越受到人们关注。已有研究表明miR-183可以通过抑制Taok1保护强刺激后的耳蜗损伤。本研究探讨噪声习服对豚鼠耳蜗内miRNA-183表达的影响，及其在习服保护过程中可能的作用机制。方法：40只雄性豚鼠随机分为正常对照组（NG组），噪声习服组（CG组），噪声习服+强噪声暴露组（CHG组），单纯强噪声暴露组（HG组）。NG组的动物放在本底噪声小于35dB的室内。噪声暴露在混响室内进行，将豚鼠编号，单只固定在特制的铁丝笼中，扬声器置于动物头部正上方。噪声暴露系统由信号发生器、功率放大器和扬声器组成。动态信号分析仪产生噪声信号，经功率放大器放大后，输入扬声器。经过查阅相关文献资料并结合既往的实验经验，最终确定习服暴露条件：倍频程噪声（中心频率为1000Hz），噪声强度为(90±l)分贝声压级，连续7天，以每天6小时的方式暴露。CHG组进行噪声习服之后，休息2天，与HG组一起接受高强度噪声暴露，噪声的频谱同习服暴露，暴露强度(112±l)dB SPL，连续暴露4h。暴露前信号发生器、功率放大器及扬声器需开机预热10分钟。每次试验前及间隔1小时采用声级计对噪声强度进行监测。采用脑干诱发电位反应阈（auditory brainstem response，ABR）测量各组动物听力阈移。以ABR阈值代表动物的听力阈值。暴露前测定每只动物的基础ABR，暴露后测定阈值并计算听力阈移。将清醒状态下的动物，于测听台上牢固固定，并将其与测听台一起共同放入隔声屏蔽箱内，豚鼠外耳道口到耳机膜片之间的距离为3cm。采用针电极测定。刺激声为click短声，测量从高声强开始（一般为90分贝），以20分贝、10分贝、5分贝依次逐渐衰减，直到出现具有可辨图形的最低声音强度，以此做为其ABR阈值，阈值强度要重复检测一次。动物断头处死后取双侧耳蜗组织，右耳蜗放入0.5%的硝酸银（AgNO3）溶液中染色、4%多聚甲醛（PFA）固定、暴光显色、剥离铺片、观察计数、铺片照相测定各组外毛细胞缺失率。将保存于液氮中的左侧耳蜗组织捣碎，用Trizol提取总RNA，整个过程在无RNA酶的环境下操作，对提取物进行分光光度计及变性凝胶测定。应用miR-183反转引物，将提取的总RNA转录成cDNA。将反转产物（cDNA）作为模板，利用miR-183扩增引物，采用实时定量PCR(Real-timequantitative PCR，qRT-PCR)方法检测各组豚鼠耳蜗中miR-183的表达水平，所有样本重复3孔，以U6分子作为内参基因。 ΔCt=CtmiR-183—CtU6， miRNA183的表达量用2-△Ct表示。用此公式计算的先决条件是PCR的扩增效率必须大于90%。PCR效率可由标准曲线的斜率得到。输入待测基因（miR-183）和参照基因（U6）cDNA以及其10倍梯度稀释的浓度值后，系统将会自动给出分别针对待测基因miRNA183和参照基因U6的标准曲线以及线性回归斜率（此斜率可以代表PCR的效率）。结果：1.噪声习服对听阈的影响。习服暴露过程中每天的阈移逐渐减少，显示了噪声习服的有效作用。对各实验组因损伤暴露引起的听力损伤的监测结果显示， CG组听力阈移较小，平均(8.7±1.4)dB，即听力损伤较轻；HG组听力阈移最大，为（42.8±9.2）dB；CHG组的听力阈移为(29.3±6.4) dB，明显小于HG组，两组比较差别非常显著(P0.01)。2.豚鼠耳蜗毛细胞的形态和结构以及各圈外毛细胞的缺失率，在噪声习服条件下的变化。在光学显微镜下，豚鼠耳蜗基底膜铺片可见：正常豚鼠，耳蜗基底膜的外毛细胞有少量自然缺失，缺失趋势在I至Ⅲ圈逐渐增多。噪声暴露后豚鼠，耳蜗外毛细胞出现纤毛损伤，表现为：缺失增多的静纤毛，排列出现散乱、融合和退行性变。其中缺失最为严重的是强噪声暴露组。外毛细胞缺失主要发生在耳蜗第Ⅱ、Ⅲ圈基底膜。IHC未发现明显损伤。外毛细胞的损伤在CG组（%，T1：0.89±0.18、T2：2.08±0.44、T3：2.26±0.84）较NG组（%，T1：0.64±0.16、T2：1.64±0.34、T3：1.81±0.38）稍微严重，但差异无显著性。HG组（%，T1：4.01±0.84、T2：6.78±1.18、T3：8.94±1.89）和CHG组（%，T1：1.24±0.21、T2：4.68±0.67、T3：6.81±0.98）与NG组相比外毛细胞缺失在I至Ⅲ圈均具有非常显著差别（P＜0.05）。CHG组与HG组相比，外毛细胞缺失在I至Ⅲ圈均有显著差别（P＜0.05），提示噪声习服暴露可减少其后强噪声损伤暴露引起的外毛细胞缺失。3.各组豚鼠耳蜗中miR-183的表达情况。结果显示，，CG组miR-183的表达量（13.04±0.86）较NG组（6.19±0.88）升高，差别显著（P＜0.05）；CHG组miR-183的表达量（4.13±0.66）较NG组降低，差别显著（P＜0.05）；HG组miR-183的表达量（1.55±0.21）较NG组降低，差别显著（P＜0.05）；HG组miR-183的表达量较CHG组降低，差别显著(P＜0.05)。研究结果提示噪声习服能够促进耳蜗组织的miR-183的表达，强噪声损伤能够降低miR-183的表达。外毛细胞的损伤在NG组和CG组无明显差异，但miR-183在CG组较NG组明显增高，而且随着外毛细胞损伤程度的加重，miR-183的表达降低。结论：一定强度噪声习服暴露可使耳蜗毛细胞产生某些变化，使其在之后的噪声暴露中损伤减轻，起到保护听力的作用；这种保护作用可能是由于噪声习服诱导耳蜗中miR-183的表达实现的，高表达的miR-183可能通过负调控其下游靶基因，抑制毛细胞的损伤和缺失，从而产生听力保护作用。因此考虑习服过程所产生的听力保护可能与miR-183水平升高有关。
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【学位授予单位】：中国人民解放军军事医学科学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R764

【参考文献】