【摘要】：第一部分PMCA2及其A端和C端剪接变异体在新生大鼠耳蜗的表达 目的研究质膜钙ATP酶异构体2(Plasma membrane Ca2+-ATPase isoform 2,PMCA2)及其A端和C端剪接变异体在新生大鼠耳蜗的表达。 方法(1)取出生3-4天(P3-P4)的大鼠,断头后分离出耳蜗,固定包埋后做冰冻切片。同时,分离出耳蜗基底膜做铺片。通过免疫荧光方法检测PMCA2在耳蜗切片以及基底膜的表达。(2)依次从P3-P4大鼠分离基底膜(BM,包含Corti’s器,下同)、螺旋神经节(SG)、螺旋韧带(SL,包含血管纹,下同)以及完整的耳蜗组织,Trizol法提取RNA并逆转录成cDNA,分别通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测PMCA2的A端和C端剪接变异体在上述耳蜗组织中的表达。(3)取同样年纪的大鼠螺旋神经节组织,体外培养后用神经元标志物抗神经微丝蛋白200抗体(NF-200)鉴定。通过免疫荧光法检测PMCA2在螺旋神经节细胞(SGCs)的表达情况;收集体外培养的SGCs,Trizol法提取总RNA并逆转录成cDNA,分别通过RT-PCR法检测PMCA2 A端和C端的剪接变异体的表达。(4)分别分离BM、SG、SL以及完整耳蜗组织,提取总蛋白后制备电泳凝胶,跑10% SDS-PAGE,之后电转到聚偏氟乙烯膜(PVDF)上,用5%脱脂奶粉在室温下封闭1h后加入兔抗PMCA2抗体(1:1000),4℃条件下孵育过夜,加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(1:2500),室温下孵育1h,用增强化学发光法显色。 结果(1) PMCA2在外毛细胞(OHCs)纤毛、SG、血管纹(SV)均有强烈表达;在Reissner’s membrane (RM)表达较弱,偶尔在内毛细胞(IHCs)纤毛有表达。(2)毛细胞纤毛所表达的PMCA2剪接变异体是w/a, SG的是z/b和z/c,SV是w/a和w/c。另外在整个耳蜗组织中,检测到PMCA2的A端剪接变异体为w、y和z,C端的为a、b和c。(3)体外培养的SGCs胞体透亮,活性良好, NF-200免疫阳性。SGCs的胞膜、胞质和轴突均发出强烈绿色荧光,表明PMCA2免疫阳性。RT-PCR结果表明SGCs所表达的A端剪接变异体为PMCA2z,而C端的剪接变异体为PMCA2b和PMCA2c。(4)通过Western blot方法,用PMCA2抗体可以检测到耳蜗组织中PMCA2的C端剪接方式。结果发现,BM和SV表达剪接体PMCA2a, SG表达PMCA2b,而整个耳蜗组织表达PMCA2a和PMCA2b,这与PCR结果一致。 结论PMCA2在新生大鼠耳蜗组织有不同水平的表达,其A端和C端的剪接变异体也存在差异性表达。 第二部分PMCA亚型在发育大鼠耳蜗毛细胞的分布 目的研究质膜钙泵亚型1-3(PMCA1-3)和5F10在发育大鼠耳蜗毛细胞的分布。 方法(1)麻醉后取出生0-21天的大鼠耳蜗,固定后分离出基底膜做铺片,通过免疫荧光方法检测PMCA亚型的分布情况。依次用0.5% Triton X-100破膜、10%正常山羊血清封闭后加入兔抗PMCA1-3或5F1(0一种能识别所有PMCA亚型的抗体)(1:1000),4℃条件下孵育过夜, PBS漂洗后加入Alexa Fluor 488标记的羊抗兔二抗(1: 400),在室温下孵育2h, PBS洗涤后加入Alexa Fluor 568标记的鬼比环肽phalloidin(1:200),在室温下孵育1h,PBS漂洗后封片。将共聚焦显微镜所有设置调节到同样的位置,观察基底膜染色情况。使用Photoshop或Image J软件测量毛细胞的免疫荧光强度,绘年龄相关性表达曲线。(2)通过免疫金标法检测PMCA2和5F10在成年大鼠耳蜗毛细胞的表达。依次固定、破膜、封闭后加入用含1%胎牛血清(BSA)和0.02% Tween 20的0.05M TBS溶液(BSA-T20-TBS)稀释的一抗PMCA2或5F10(1:50),漂洗后加入用BSA-T20-TBS稀释的结合有15nm金标颗粒的羊抗兔IgG二抗(1:20),在室温下孵育2h,洗涤后用水样乙酸双氧铀染色20min,在透射电子显微镜下观察标记情况。 结果(1)在整个发育过程中,PMCA1在OHCs和IHCs纤毛均没有表达。在出生后的6天内,PMCA1在OHCs和IHCs的胞体均有表达,之后在OHCs胞体的表达水平逐渐下降,到成年期几乎全部消失。而在IHCs胞体,PMCA1的表达逐渐增强,进入成年期才保持稳定水平。(2)刚出生的第一周,PMCA2在OHCs纤毛的表达快速增强,首先出现在底回OHCs纤毛,然后是中回,最后是顶回,底回的表达强于顶回。到了P8,PMCA2在OHCs纤毛的表达基本达到成年水平,顶回、中回和底回之间没有明显的区别。在出生后10天内, PMCA2在IHCs纤毛有微弱的表达,但到P13后基本消失。在整个发育阶段,PMCA2在OHCs和IHCs的胞体均没有表达。(3)在整个发育过程,PMCA3在OHCs和IHCs纤毛没有表达,但在出生6天内在OHCs和IHCs胞体均有表达。到P13以后,PMCA3在OHCs胞体的表达基本消失,在IHCs胞体的表达虽然稍有下降,但仍处于较高水平,并维持到成年期。(4)5F10在OHCs和IHCs纤毛的表达模式和PMCA2的相似。5F10在OHCs和IHCs胞体的表达在出生后6天逐渐增强,之后逐渐下降,在OHCs胞体的表达到成年期几乎消失,在IHCs胞体的表达却相反,仍维持在一定的水平进入成年。(5)免疫金标结果显示,PMCA2在成年大鼠耳蜗OHCs的3排静纤毛上分布的金标颗粒数量相差不明显。PMCA2和5F10在OHCs纤毛上分布的金标颗粒数量分别是IHCs纤毛的3.8倍和2倍。PMCA2在顶回OHCs纤毛分布的金标颗粒数量与底回的没明显区别。 结论PMCA2在OHCs纤毛开始表达的时间(P0-P6)和机械电转导电流出现时间是一致的。PMCA2在IHCs纤毛的表达弱于OHCs纤毛,表明IHCs的Ca2+负荷比OHCs小。PMCA2在成年大鼠顶回和底回OHCs纤毛的表达没有明显差异。PMCA1和PMCA3主要分布于IHCs胞体。5F10在P2-P6大鼠的IHCs胞体的表达变化符合IHCs胞体的Ca2+电流变化。由于毛细胞主要依靠PMCA来调控细胞内Ca2+水平,因此这种差异性表达可能是由于PMCA的不同亚型在毛细胞发挥着特殊的功能。 第三部分PMCA亚型在新生大鼠耳蜗基底膜的表达 目的通过Western blot方法比较质膜钙泵亚型1-3(PMCA1-3)在P2和P8大鼠耳蜗基底膜的表达差异,并检测PMCA2在P8大鼠耳蜗毛细胞的表达量。 方法(1)分别取出生2天和8天的健康SD大鼠各4只,麻醉后分离出BM,剔除RM和TM,提取总蛋白后测量蛋白浓度,分别上样3μg和5μg总蛋白,跑7.5 % SDS-PAGE,之后电转到硝酸纤维素膜上,用5%脱脂奶粉室温封闭2h后加入PMCA2抗体(1:1000),4℃条件下孵育过夜,洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1:2000),室温孵育1h,洗涤后用增强化学发光法显色。(2)分别取P2和P8大鼠基底膜,提取总蛋白后,分别上样20μg总蛋白跑7.5 % SDS-PAGE,转膜后分别加兔抗PMCA1-3抗体(1:1000),其余步骤同(1)。(3)分别上样P8大鼠基底膜总蛋白5μg、10μg和20μg,以及100ng、400ng和800ng BSA蛋白作为对照组,跑7.5 % SDS-PAGE。跑完电泳后将胶分为2部分,部分泳道(含10μg和20μg总蛋白以及100 ng、400 ng和800ng BAS蛋白)用于SYPRO染胶。另一部分泳道(含5μg总蛋白)用来做Western blot,检测PMCA2的表达,具体步骤同(1)。通过对比SYPRO染胶后的条带和Western blot实验后底片上的条带,确定PMCA2条带位置,用Photoshop或Image J软件测量其灰度值,通过计算得出该条带的PMCA2含量。 结果(1)PMCA2在P2和P8大鼠BM均有表达,在P8的含量高于在P2的。(2) PMCA1在P2和P8大鼠BM有微弱的表达,两者之间没有明显差别;PMCA2在P2和P8大鼠BM的含量非常丰富;PMCA3在P2和P8大鼠的BM几乎没有表达。(3)PMCA2在单个P8大鼠BM的含量约为2.5 ng。 结论PMCA1-3在P2和P8的BM有着不同的表达水平。PMCA1表达较弱,PMCA2有着强烈的表达,并与年龄的增长呈正相关,PMCA3无明显表达。PMCA1-3在新生大鼠基底膜不同的分布说明了耳蜗毛细胞对这几种PMCA亚型有着特殊的Ca2+调节需求。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R764
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