萘性白内障的氧化机制及液体纯牛奶对其作用研究

发布时间：2018-12-10 08:53

【摘要】： 第一部分萘性白内障的氧化损伤机制及钙蛋白酶Ⅱ在氧化损伤中的作用目的通过萘性白内障氧化损伤及钙蛋白酶活性的研究,并结合萘性白内障α晶状体蛋白翻译后修饰及分子伴娘活性的探讨,揭示钙蛋白酶Ⅱ在白内障氧化损伤中的作用及萘性白内障作为年龄相关性白内障的可靠性及可行性,为进一步的研究打下了基础。材料与方法30只150g雌性SD大鼠被随机分成2组：对照组、萘组。每周进行裂隙灯照相及灰度分析；第9周实验结束时进行血浆及晶状体中还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)及细胞内外钙离子的检测；通过HPLC法进行晶状体匀浆的蛋白分离获得α晶状体蛋白,将α晶状体蛋白通过双向电泳进一步分离,然后通过MALDI-TOF-TOF系统进行双向电泳上位点的鉴定及翻译后修饰分析；通过α晶状体蛋白抑制βL-晶状体蛋白凝聚反应实验检测a晶状体蛋白的分子伴娘活性强弱,并通过酪蛋白的水解程度判断钙蛋白酶Ⅱ活性的变化。结果从第3周开始,萘组晶状体皮质灰度明显高于对照组,差异具有统计学意义(p＜0.01),萘组晶状体核灰度值自第3周起亦稍微高于对照组,差异具有统计学意义(p＜0.01)。第9周时,萘组晶状体上皮细胞凋亡数明显高于对照组,差异具有统计学意义(p＜0.01)；萘组血浆及晶状体中GSH水平低于对照组,差异具有统计学意义(p＜0.05)；而MDA明显高于对照组,差异具有统计学意义(p＜0.05)；萘组细胞内外钙离子水平明显高于对照组,钙蛋白酶活性明显高于对照组,差异具有统计学意义(p＜0.05)。本研究通过蛋白质组学研究鉴定出了α晶状体蛋白的氧化、乙酰化、磷酸化、氨基甲酰化、甲基化等翻译后修饰,并且在萘组鉴定出了C-端断裂位点；另外,我们的数据亦表明,萘组α晶状体蛋白分子伴娘活性明显降低,和对照组相比,差别具有统计学意义(p＜0.01)。结论本研究相对系统的报道了萘性白内障大鼠大体及组织细胞学损伤及晶状体蛋白的翻译后修饰的变化,并通过钙蛋白酶活性的研究证实了钙蛋白酶Ⅱ的活性升高在萘性白内障的氧化损伤中起到重要作用,从而在一定程度上证明了萘性白内障是一种可靠的、可重复性较好的年龄相关性白内障模型,为进一步的研究打下了基础。第二部分钙蛋白酶Ⅱ在萘醌诱导的细胞氧化损伤中的作用及其分子机制研究目的进一步探讨氧化损伤条件下,钙蛋白酶Ⅱ活性增强的原因及对晶状体上皮细胞的影响。材料与方法将永生性人晶状体上皮细胞系SRAO1／04分三组：A组：对照组、B组：萘醌组、C组：萘醌+E64D组。分12小时、24小时、36小时三个时间点,流式细胞仪分析细胞凋亡情况；荧光探针DCFH-DA法检测细胞中活性氧的变化；共聚焦显微镜观察与分析氧化损伤对细胞内钙的影响；免疫组化及Western blot法分析钙蛋白酶Ⅱ在细胞内的分布与蛋白水平的表达,Real Time-PCR法检测钙蛋白酶Ⅱ在m RNA水平的表达；通过Western blot法分析作为钙蛋白酶Ⅱ的底物的αB-晶状体蛋白量的变化,间接反应钙蛋白酶Ⅱ的活性。结果三个时间点萘醌组及萘醌+E64D组晶状体上皮细胞的凋亡率均明显高于对照组,萘醌组晶状体上皮细胞的凋亡率明显高于萘醌+E64D组；除处理后的第12小时萘醌+E64D组细胞中活性氧水平与对照组无明显差别外,其他两个时间点萘醌组及萘醌+E64D组晶状体上皮细胞中活性氧的水平明显高于对照组,三个时间点,萘醌组晶状体上皮细胞中活性氧的水平明显高于萘醌+E64D组；除处理后的第12小时萘醌+E64D组细胞内的钙离子浓度与对照组无明显差别外,其他两个时间点萘醌组及萘醌+E64D组细胞内的钙离子浓度明显于对照组,而三个时间点,萘醌+E64D组细胞内的钙离子浓度略低于萘醌组；三个时间点,钙蛋白酶Ⅱ蛋白质及mRNA水平的表达量为萘醌组萘醌+E64D组对照组,差异具有统计学意义(p＜0.01)。而αB晶状体蛋白的量的变化为对照组萘醌+E64D组萘醌组,差异具有统计学意义(p＜0.01) 结论本研究进一步验证了萘醌对晶状体上皮细胞的氧化损伤在一定程度上与钙蛋白酶Ⅱ表达量的增加及活性增强有关,而钙蛋白酶抑制剂E64D可抑制钙蛋白酶Ⅱ的表达及钙蛋白酶的活性,从而对氧化损伤具有一定的保护作用。第三部分液体纯牛奶对萘性白内障的影响及作用机制研究目的探讨液体纯牛奶对萘性白内障的影响及可能的作用机制。材料与方法90只150g雌性SD大鼠被随机分成6组：对照组、正常量牛奶组、过量牛奶组、萘组、萘加正常牛奶组、萘加过量牛奶组。每周进行裂隙灯照相及灰度分析,第9周实验结束时进行血浆及晶状体中的半乳糖、钙离子、氧自由基(ROS)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)测量。结果皮质灰度方面,从第3周开始,萘加过量牛奶组晶状体皮质绕核区灰度明显高于萘组,至实验结束,萘加正常牛奶组绕核区灰度和萘组相比差别无统计学意义。从第8周开始,过量牛奶组皮质灰度稍过于对照组,至实验结束,正常牛奶组晶状体皮质灰度与对照组相比差别无明显统计学意义。核灰度方面,至实验结束,正常牛奶组及过量牛奶组与对照组之间及正常牛奶加萘组与萘组之间灰度差别无统计学意义。从第3周开始,萘加过量牛奶组晶状体核灰度值高于其它各组。第9周时,过量牛奶组血浆及晶状体中ROS略高于对照组,而正常牛奶组血浆及晶状体中ROS水平与对照组相比差别无统计学意义；萘加过量牛奶组血浆及晶状体中ROS明显高于萘组,而萘加正常牛奶组血浆晶状体中ROS水平与萘组相比差别无统计学意义。过量牛奶组血浆及晶状体中GSH略低于对照组,而正常牛奶组血浆晶状体中GSH水平与对照组相比差别无统计学意义；萘加过量牛奶组血浆及晶状体中GSH明显低于萘组,而萘加正常牛奶组血浆晶状体中GSH水平与萘组相比差别无统计学意义。过量牛奶组血浆及晶状体中MDA略高于对照组,而正常牛奶组血浆及晶状体中MDA水平与对照组相比差别无统计学意义；萘加过量牛奶组血浆及晶状体中MDA明显高于萘组,而萘加正常牛奶组血浆晶状体中MDA水平与萘组相比差别无统计学意义。过量牛奶组血浆中Ca2+浓度略高于对照组,但差异无明显统计学意义(p=0.08),该组房水及晶状体中Ca2+浓度与对照组相比差别亦无统计学意义；萘组血浆、房水及晶状体Ca2+明显高于对照组(p＜0.05)。结论本研究通过灰度定量方法证实过量牛奶可以促进萘性白内障的发生发展,这种作用的机制可能与牛奶成分在体内代谢过程中产生过多的氧自由基有关。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R776.1

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