erl小鼠CDH23氨基端两个结构域的表达及其与钙离子结合性能的实验研究

发布时间：2020-03-31 09:36

【摘要】：目的:erl(erlong,erl)小鼠是在C57BL/6J小鼠背景基础上,新近筛选制备的研究非综合征常染色体隐性遗传性耳聋(DFNB12)的模型小鼠。erl是钙粘蛋白23基因新发现的等位基因位点,该基因突变导致CDH23蛋白第一个细胞外结构域(CDH23EC1)氨基酸发生替换(S47P),引起CDH23蛋白二级结构如a-螺旋、β-折叠等的改变,影响蛋白质高级结构的组成。本课题旨在研究CDH23钙黏蛋白氨基端前两个细胞外结构域(EC1+2)的钙离子结合性能,探讨erl小鼠听力损害的可能机制。方法:本研究利用基因工程技术,在大肠杆菌中表达erl小鼠CDH23的前两个细胞外结构域,进一步鉴定该重组蛋白与Ca2+结合性能的改变。在体外分别合成来自野生型和erl小鼠的CDH23EC1+2的DNA序列,并将其克隆到pBV220质粒中。将重组质粒转化大肠杆菌,通过温度诱导的方式(从30℃升高至42℃)诱导CDH23EC1+2在大肠杆菌中表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析重组蛋白,并用Western Blot鉴定其抗原性。用8M尿素溶解包涵体,通过离子交换层析和凝胶过滤层析纯化蛋白,并在含有0.1%sarkosy1的透析液中通过透析复性的方法使其再折叠。采用Mag-Fluo4 Ca2+荧光探针和Ca2+依赖性的胰蛋白酶水解保护实验鉴定重组蛋白CDH23 EC1+2的Ca2+结合性能。结果:重组质粒中的插入片段与预期的大小及序列一致,重组蛋白以包涵体的形式表达于大肠杆菌,具有抗原性。将包涵体变性、复性后,用圆二色谱法(CD)进一步证实了重组蛋白的二级结构。Mag-Fluo4 Ca2+荧光探针和Ca2+依赖性的胰蛋白酶水解保护实验表明,与野生型CDH23EC1+2相比,来自erl小鼠的CDH23EC1+2的Ca2+结合能力减弱。结论:Ca2+依赖性蛋白质相互作用的损害可能参与erl小鼠渐进性听力损失的发生发展过程。该结果有助于进一步揭示DFNB12听力损失的机制。
【图文】：

逦滨州医学院硕士学位论文材料和方法逡逑一、实验材料逡逑（ ）细菌菌株与质粒逡逑１．细菌菌株：￡．ｃｏ／／Ｄ／／５ｏ，本实验室保存。基因型：ＳＵｐＥ４４ＡｌａｃＵ１６９邋（ｃｐ８０邋１Ａ邋Ｍ１５）邋ｈｓｄＲ１７ｒｅｃＡｌ邋ｅｎｄＡｌ邋ｇｙｒＡ９６邋ｔｈｉ－１邋ｒｅｌＡｌ逡逑２．质粒载体：ｐＵＣ５７：长度为２７１０ｂｐ，含一个８０ｂｐ多克隆酶切位点、ｐ－半苷酶（ＬａｃＺ）基因插入失活、氨苄青霉素（Ａｍｐ）抗性位点等（图１－１）。逡逑ｆＣ００１０９（邋２６９８邋Ｐｆｏ＼邋４６邋Ｓｓ／ＡＰＩ邋１７９逡逑

ＬＢ培养基中，继续培养至对数期ＯＤ６００＝００．６左右，转入４２°Ｃ，剧烈震荡培养６ｈ。逡逑每隔１小时取出１．５ｍＬ菌液，５０００ｇ离心５ｍｉｎ，弃去培养液。将不同时间段诱导菌液逡逑样品进行１２％ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳，，４ｈ目的蛋白表达量达最高峰。（图４）逡逑（Ａ）逦（Ｂ）逡逑ｕａ邋１２３４５６７８邋ｋＤａ邋１逦２逦３逦４逦５逦６逦７逦８逡逑１８０—．逦一邋一￣邋…１８０邋—邋：—邋—邋－ｒｒ．邋—１邋￣邋—邋ＺＩＩ邋—逡逑７。々，ｔｉｉ篇憸灥曑逡逑２５邋一，墨Ｉｆ２５－：灄W曑－逡逑—ｒｉｒｔｌ．５—邋曑，逡逑图４．不同时间诱导的ＣＤＨ２３ＥＣ１＋２（ＷＴ）、（Ｍ）的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ结果逡逑（八）１列：蛋白１１１耵１？１＇；２列：未诱导的（：办２３及：１＋２（识丁）中８NB２２０－￡＞／／５￡７；３－８列：（＾；２２３￡＜：丨＋２逡逑（ＷＴ）／ｐＢＶ２２０－邋Ｄ／／５ｏ分别诱导邋１邋ｈ，邋２邋ｈ，邋３邋ｈ，邋４邋ｈ，邋５邋ｈ，邋６邋ｈ．邋（Ｂ）〗列：蛋白邋ｍａｒｋｅｒ；邋２邋列：未诱导的逡逑３－８邋列：Ｑ／Ｗ３仪：ｌ＋２邋（Ｍ）／ｐＢＶ２２０－Ｄ／／５ｏ分别诱导邋ｌｈ，邋２ｈ，邋３ｈ，逡逑４ｈ
【学位授予单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R764.43

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本文编号：2608899