自噬诱导多肽Tat-beclin1在大鼠急性高眼压视网膜损伤中的保护作用研究

发布时间：2020-03-31 13:53

【摘要】：目的:研究自噬诱导多肽tat-beclin1在SD大鼠急性高眼压损伤模型中对视网膜神经节细胞(Retinal ganglion cell,RGC)的保护作用,以及初步探讨这一保护作用中自噬和凋亡的相互关系和机制,为青光眼性视神经保护提供新的思路。方法:(1)用胰酶消化法分离、体外培养原代大鼠视网膜神经细胞,检测tat-beclin1对正常原代大鼠视网膜神经细胞以及氧糖剥夺/再复氧损伤后细胞活性的影响。(2)选取8周龄SD大鼠,在大鼠右眼行前房灌注无菌0.9%氯化钠溶液建立大鼠急性高眼压模型。前房灌注结束后,在右眼行玻璃体腔注射tat-beclin1(2.5μg)溶液。左眼作为假手术对照。于再灌注6h、12h、24h、48h、3d、7d后处死大鼠摘取眼球,制作视网膜石蜡切片行HE染色观察视网膜形态学改变,行TUNEL染色检测视网膜各层细胞凋亡的情况。制作视网膜平铺片利用荧光金(Fluoro-Gold,FG)逆行标记RGCs检测其数目变化。取完整视网膜组织行蛋白质免疫印迹试验检测凋亡执行因子cleaved caspase-3以及自噬相关蛋白beclin1、p62 和 LC3Ⅱ/Ⅰ 的表达。结果:(1)tat-beclin 1显著增强正常原代大鼠视网膜神经细胞及氧糖剥夺/再复氧损伤后的细胞活性(P0.001)。(2)HE染色显示急性高眼压6h和24h视网膜内层厚度增加,3d和7d视网膜内层显著变薄,视网膜各层结构排列紊乱,RGCs出现核固缩。Tat-beclin1治疗组的视网膜结构与厚度较阴性对照PBS组有所恢复。视网膜急性高眼压损伤24h后tat-beclin1组(51.2±4.3个/mm2)TUNEL染色阳性细胞数量显著少于阴性对照PBS组(133.2±5.6个/mm2)。FG逆行标记RGCs测得急性高眼压3d后RGCs的存活率为47.3%±5.4%,tat-beclin1治疗组RGCs的存活率为73.0%±3.2%。急性高眼压24h后,与阴性对照PBS组相比,tat-beclin1治疗组视网膜组织中活化型caspase-3(P0.001)的表达显著下调,且beclin 1与LC3Ⅱ的表达显著上调,p62表达下调。结论:自噬诱导多肽tat-beclin 1对原代大鼠视网膜神经细胞氧糖剥夺/再复氧损伤以及大鼠视网膜急性高眼压损伤有修复保护作用,自噬相关蛋白的动态变化提示tat-beclin 1诱导自噬水平上调对RGCs的凋亡具有抑制作用。
【图文】：

神经细胞,自噬,细胞活性,多肽

显微镜下观察可见，细胞刚接种时为圆球状，接种２小时后，大部分细胞贴逡逑壁。接种２４小时后，细胞基本完全贴壁，单层排列，少量细胞伸出短小的突起。逡逑如图３．１Ａ所示，接种３－６天后，神经细胞突起明显伸长增多，细胞趋向于聚集逡逑生长且其突起形成相互链接，有些呈串珠样排列，部分细胞突起交织成网状。７逡逑天后神经细胞体积开始变小，１４天后细胞开始逐渐死亡。逡逑本实验首先观察自噬诱导多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１对正常原代大鼠视网膜神经细胞逡逑细胞活性的影响。如图３．１Ｂ所示，２．５ｐＭ、５ｍＭ及ｌＯｕＭｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１处理２小时逡逑后的ＤＩＶ６（６ｄ邋ｉｎ邋ｖｉｔｒｏ）神经细胞经ＣＣＫ－８法检测显示细胞活性增强，且５ｐＭ及逡逑ｌ0ＭＭ邋ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１处理组的神经细胞活性与无药物处理对照组相比较有统计学差逡逑异（Ｐ＜０．００１）。而经ｔａｔ－ｓｃｒａｍｂｌｅｄ处理的神经细胞活性较无药物处理对照组无明显逡逑变化。逡逑自噬诱导多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１预处理对氧糖剥夺１小时／再复氧１小时后的原代逡逑大鼠视网膜神经细胞的影响如图３．１Ｃ－Ｄ所示，经ＣＣＫ－８法检测得氧糖剥夺／再逡逑复氧损伤后的原代大鼠视网膜神经细胞的细胞活性明显减弱且与正常对照组相逡逑比较有统计学差异（ＰＯ．ＯＯｌ）。２．５ｍＭ及５ｎＭ自噬诱导多肽ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１预处理对逡逑氧糖剥夺／再复氧损伤后的原代大鼠视网膜神经细胞有显著的保护作用，ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ逡逑１处理组的细胞活性较氧糖剥夺／再复氧损伤组的细胞活性明显增强，且５ｐＭ逡逑ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１处理组的细胞活性较正常对照组增强且有统计学差异（Ｐ

照片,自噬,网膜,眼球

３．２自噬诱导多肽Ｔａｔ－ｂｅｃｌｉｎ邋１对视网膜组织结构急性高眼压损伤的逡逑影响逡逑手术显微镜下可见（图３．２Ａ），生理盐水灌注开始后，原本淡粉色的大鼠瞳逡逑孔由于生理盐水灌注导致缺血而变白，维持高眼压６０分钟后停止灌注，眼球血逡逑液循环恢复。急性高眼压６ｈ、２４ｈ、３ｄ、７ｄ后处死大鼠，摘取眼球，制作视网膜逡逑石蜡切片并行Ｈ＆Ｅ染色。逡逑视网膜连续石蜡切片Ｈ＆Ｅ染色结果如图３．２邋Ｂ－Ｃ所示，假手术组的大鼠视逡逑网膜组织结构层次清晰分明，视网膜内界膜平整，各层细胞整齐排列，神经节细逡逑胞呈单层排列的六角形细胞，胞核为圆形或椭圆形，，胞核较大；内丛状层为较厚逡逑的致密网状结构；内核层主要由双极细胞、水平细胞、无长突细胞和Ｍｔｔｌｌｅｒ细逡逑胞的细胞核组成，染色较深；外核层较内核层厚，排列更为紧密。逡逑如图３．２邋Ｄ－Ｅ统计学结果显示，急性高眼压损伤６ｈ及２４ｈ后，阴性对照ＰＢＳ逡逑组的大鼠视网膜各层组织出现了明显的水肿情况
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R775;R774.1

【参考文献】