DC-SIGNR介导EBV感染鼻咽上皮细胞的相关研究

发布时间：2020-05-07 03:28

【摘要】：目的:构建DC-SIGNR(dendritic cell-specific ICAM-3-grabbing non-integrin-related protein,树突状细胞特异性细胞间粘附分子3非整合素因子相关蛋白)慢病毒表达载体,设计EBV直接感染及淋巴细胞共培养间接感染两种模式,探讨DC-SIGNR是否具有促进EBV感染上皮细胞的作用,为进一步探讨EBV感染鼻咽上皮细胞的分子机制奠定基础。方法:1、制备EBV颗粒:通过胃腺癌细胞AGS-EBV-GFP制备EBV-GFP;2、EBV颗粒与淋巴瘤KMH2细胞直接接触培养,用荧光显微镜观察;3、EBV颗粒与候选的NPC细胞和鼻咽部永生化上皮细胞直接接触感染模式:用制备的EBV颗粒直接与各靶细胞包括HONE1、HK1、CNE1、NP69接触感染,后用实时荧光定量PCR检测NPC细胞中EBV相关分子EBER、EBNA1、LMP1、LMP2A表达量;4、构建慢病毒DC-SIGNR过表达载体,上调其在NPC细胞HONE1及鼻咽部永生化上皮细胞株NP69上的表达,EBV颗粒直接感染,用RTFQ PCR检测细胞中EBV相关分子EBER、EBNA1、LMP1、LMP2A表达量;检测其是否具有直接促进EBV感染的作用;5、构建慢病毒DC-SIGNR过表达载体上调DC-SIGNR在RAJI细胞中的表达:通过RAJI-DC-SIGNR及RAJI-CONTROL细胞模型与NPC细胞、正常鼻咽部上皮永生化细胞共培养间接感染模式,共培养48h后,经抗体激活补体依赖的杀伤实验去除共培养RAJI细胞,用RTFQ PCR和Western Blot检测EBV相关分子及其表达量。结果:1、荧光显微镜视野下观察淋巴瘤KMH2细胞与EBV悬液直接接触培养后,使原本不具有绿色荧光的KMH2具有绿色荧光。成功制备具有感染能力的EB病毒颗粒。2、成功构建DC-SIGNR过表达的鼻咽癌细胞系通过测序结果验证,证明DC-SIGNR慢病毒表达载体构建成功。3、上调DC-SIGNR表达前后的各种NPC细胞及鼻咽部永生化细胞系NP69与EB病毒颗粒直接接触培养后,未观察到EBV感染的绿色荧光。同时RTFQ PCR结果显示,其EBV相关分子(EBER、EBNA1、LMP2A、LMP1)表达亦基本无法检出。4、上调RAJI细胞中DC-SIGNR的表达(RAJI-DC-SIGNR)与对照组(RAJI-CONTROL)相比明显增强EBV感染NPC细胞后相关分子的表达,但是确仍然无法提高EBV感染NP69的效率。(1)与RAJI-DC-SIGNR共培养后HONE1的EBV相关分子m RNA相对表达量(2-△△Ct)结果显示:EBER(3.42±0.11)和EBNA1(3.21±0.84)较与RAJI-CONTROL(阴性对照组)共培养后的EBER(1.24±0.27)和EBNA1(1.56±0.49)表达量均显著升高,p值分别为0.002和0.0432。而LMP1(1.05±0.30vs1.37±0.52)和LMP2A(1.20±0.11 vs1.12±0.12)的相对含量(2-△△Ct)两组未见显著差别,p值分别为0.4119和0.4588。(2)与RAJI-DC-SIGNR共培养后的HK1的EBER(75.46±10.43)、EBNA1(1.45±0.18)、LMP1(7.38±3.58)、LMP2A(5.68±1.67)较与RAJI-CONTROL(阴性对照组)共培养后的EBER(1.52±0.46)、EBNA1(1.05±0.05)、LMP1(1.20±0.22)、LMP2A(1.09±0.08)表达量均显著升高,p值分别为0.003、0.0203、0.0407和0.0090。(3)与RAJI-DC-SIGNR共培养后的CNE1的EBER(6.82±1.14)、EBNA1(4.62±1.77)、LMP1(12.27±1.70)较RAJI-CONTROL(阴性对照组)共培养后的EBER(1.12±0.10)、EBNA1(1.46±0.50)、LMP1 m RNA(2.08±0.94)表达量均显著升高升高,p值分别为0.0010、0.0401和0.0008。而LMP2A(0.99±0.49 vs 0.67±0.31)的相对含量未见显著差别,p值为0.3938。5、Western-blot结果显示,各NPC细胞株与RAJI-DC-SIGNR共培养后,表达的EBNA1蛋白量显著高于与RAJI-CONROL(阴性对照组)共培养后的表达量。其中与RAJI-DC-SIGNR、RAJI-CONTROL共培养48h后的HONE1细胞株EBNA1蛋白表达量,其灰度值依次计算为0.36±0.05、0.22±0.05,差别显著(P=0.0267)。与RAJI-DC-SIGNR、RAJI-CONTROL共培养48h后的HK1细胞株EBNA1蛋白表达量,其灰度值依次计算为0.46±0.01、0.41±0.00,两者差别有显著意义(P=0.0020)。RAJI-DC-SIGNR、RAJI-CONTROL共培养48h后的CNE1细胞株EBNA1蛋白表达量,其灰度值依次计算为0.50±0.04、0.45±0.04,两者差别无显著意义(P=0.2168)。RAJI-DC-SIGNR共培养后的HONE1、HK1、CNE1中EBNA1蛋白表达量明显高于空载慢病毒感染的RAJI-CONTROL(阴性对照组),P分别为0.0267、0.0020和0.2168。6、鼻咽部永生化上皮细胞系NP69在上调DC-SIGNR前后无论是与EB病毒颗粒直接感染模式还是淋巴瘤RAJI细胞共培养间接感染模式,实时荧光定量PCR均未能发现EBER、EBNA1、LMP2A、LMP1 m RNA表达量明显改变。结论:1、在体外模型实验中,EBV悬液可能较难直接感染鼻咽癌细胞和鼻咽部上皮细胞。2、EBV可能主要以细胞与细胞间间接接触的间接模式感染鼻咽癌细胞。3、DC-SIGNR在细胞与细胞间间接接触模式下能够提高鼻咽癌细胞EBV感染效率,其不是鼻咽癌细胞表面EBV直接受体,而是可能作为间接受体促进EBV的感染。4、在体外模型实验中,在直接模式或细胞与细胞接触间接模式中正常鼻咽部正常永生化上皮细胞可能较难感染上EBV。
【图文】：

原理图,原理图,荧光物质,荧光探针

备的EBV病毒悬液使用RTFQ PCR（TaqMan 探量。：TaqMan 探针法是使用5’端带有荧光物质（灭物质（如：TAMRA等）的TaqMan 探针进行完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质TaqMan 探针被分解后，，5’端的荧光物质便会CR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火版杂交。在进一步PCR反应的延伸过程中，TaqD板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。通度，达到PCR产物扩增量的目的。

慢病毒感染

图 2 慢病毒感染目的基因的 ORFFigure 2 The ORF of the target gene of lentivirus infec病毒序列：95-Lv105 （7 重复）GGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGGCCAAGTCCGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATGTACATGACCTTACGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGATCACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGATTCTAGATTCGAAGAACACAAAAAAGCAGGCTTGGAAGGAGTTCGAACCATGAGTGACTCCAAGGAACCAGCAGCTGGGCCTCCTGGAAGAAGATCCAACAACCAGTGGCATCAGACTTTTTCTTTCAATTCCAGCAGATACATGGCCACAAGAGCTCTACAGGGTGTCTTGGC
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.63

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