NLRX1基因在调控顺铂耳毒性中的机制研究

发布时间：2020-05-22 23:15

【摘要】：第一部分NLRX1调控顺铂耳毒性与ROS/JNK信号关系的研究Study on the relatiohship of NLRX1 and ROS/JNK Signaling in Regulating Cisplatin-induced Ototoxity目的:顺铂是常用于癌症治疗的有效化疗药物,但由于其严重的耳毒性而限于使用,目前认为活性氧(ROS),线粒体损伤,细胞凋亡和炎症损伤参与顺铂耳毒性的发病机理,但确切机制尚不明了。含核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列的蛋白家族成员X1(NLRX1)位于细胞线粒体,可识别胞浆模式识别受体,与ROS产生、线粒体功能、细胞凋亡以及炎症反应密切相关。本研究旨在探索NLRX1在顺铂耳毒性中是否存在调控作用及其调控机制,为阐明顺铂耳毒性机制和预防顺铂耳毒性的发生提供新思路和理论基础。方法:(1)通过免疫荧光,实时荧光定量聚合酶联反应(qRT-PCR)及Western-blot方法检测NLRX1在HEI-OC1听细胞系内的定位及表达。(2)TT法结合TUNEL、流式细胞术检测顺铂对HEI-OC1细胞活力的影响以及细胞凋亡变化。(3)qRT-PCR及Western-blot方法检测顺铂刺激下NLRX1在HEI-OC1细胞中的表达变化,免疫荧光检测顺铂刺激下ROS产生水平。(4)通过细胞转染技术构建NLRX1过表达及NLRX1沉默细胞,通过小鼠内耳基底膜原代培养建立小鼠顺铂内耳损伤的体外模型。(5)利用流式细胞术检测顺铂在NLRX1沉默及其过表达的细胞中诱导的细胞凋亡情况,Western-blot技术检测NLRX1沉默及其过表达细胞中顺铂诱导的凋亡相关因子 cleaved caspase3,bax及bcl-2的表达变化,评估线粒体凋亡信号。(6)利用流式细胞术检测NLRX1沉默及其过表达细胞中顺铂诱导的ROS产生水平,Western-blot技术检测NLRX1沉默及其过表达细胞中顺铂刺激对JNK磷酸化水平的影响,检测JNK信号激活情况。(7)阻滞ROS/JNK信号,Western-blot检测NLRX1过表达细胞中顺铂诱导的线粒体凋亡相关因子cleaved caspase3,bax及bcl-2的表达变化。(8)通过免疫荧光及Western-blot技术检测顺铂刺激下耳蜗基底膜中NLRX1、ROS/JNK及凋亡信号变化。结果:(1)NLRX1在HEI-OC1细胞中的表达:NLRX1在HEI-OC1细胞中呈点状表达,并且与线粒体标记物Mitotraker共染,表明NLRX1表达于HEI-OC1细胞线粒体。(2)顺铂诱导HEI-OC1细胞凋亡及细胞损伤:随着顺铂作用浓度以及时间的增加,HEI-OC1的细胞活力逐渐下降,并呈现出时间和浓度依赖性的特点,顺铂可以通过诱导HEI-OC1细胞凋亡引起细胞死亡。(3)顺铂促进HEI-OC1细胞NLRX1表达和ROS产生:在顺铂刺激下,NLRX1表达升高,并在24小时达到峰值,ROS随着顺铂作用时间延长而升高并于24小时达到峰值。(4)NLRX1增加顺铂诱导的HEI-OC1细胞凋亡:NLRX1通过影响cleaved caspase3,bax及bcl-2凋亡相关因子表达激活线粒体途径细胞凋亡。(5)NLRX1沉默下调顺铂引起的的ROS产生及JNK信号激活,NLRX1过表达上调顺铂引起的的ROS产生及JNK信号激活。(6)NLRX1促进顺铂诱导的细胞凋亡与ROS/JNK信号通路活化有关:抑制ROS过量生成或者JNK信号激活,显著减弱了 NLRX1引起的线粒体途径细胞凋亡。(7)顺铂刺激下小鼠耳蜗基底膜毛细胞明显损伤,NLRX1表达增加、ROS/JNK信号及线粒体途径细胞凋亡信号激活。结论:首次在HEI-OC1听细胞揭示了 NLRX1通过激活ROS/JNK信号启动内源性细胞凋亡途径,增加顺铂对内耳听细胞的毒性作用,阐明了 NLRX1在顺铂耳毒性发生机制中的调控作用。第二部分NLRX1介导的自噬在顺铂致耳毒性中的作用机制研究Study on the mechanism underlying the action of NLRX1-mediated autophagy in cisplatin-induced Ototoxity目的:NLRX1与活性氧产生、线粒体功能、自噬反应密切相关。本研究旨在探索NLRX1介导的自噬在顺铂耳毒性中的作用机制,为阐明顺铂耳毒性机制和预防顺铂耳毒性的发生提供新思路。方法:(1)通过免疫荧光、Western-blot检测不同剂量顺铂处理组HEI-OC1细胞中NLRX1、LC3-Ⅱ的表达变化。(2)利用MTT方法检测不同剂量顺铂处理的HEI-OC1细胞活力。(3)利用透射电子显微镜技术(TEM)检测不同处理组HEI-OC1细胞超微结构变化,自噬小体形成状况。(4)利用质粒转染法构建NLRX1过表达HEI-OC1细胞,western-blot检测NLRX1及LC3-Ⅱ表达,透射电镜观察NLRX1表达组及转染对照组细胞内自噬小体形成情况。(5)免疫荧光及western-blot检测NLRX1沉默组(siRNA-nlrxl)及转染对照组(SC)HEI-OC1细胞在顺铂处理后NLRX1、LC3-Ⅱ的表达变化,MTT方法检测相应不同处理组的细胞活力。(6)免疫荧光及western-blot检测NLRX1过表达组(nlrxl-KI)及转染对照组(vector-control)HEI-OC1细胞在顺铂处理后NLRX1、LC3-Ⅱ的表达变化,MTT方法检测相应不同处理组的细胞活力。(7)透射电镜观察NLRX1过表达组及转染对照组细胞线粒体形态及数量变化,免疫荧光及流式细胞术检测不同转染组在顺铂刺激下线粒体ROS水平。(8)抑制ROS产生或者自噬,检测顺铂处理后自噬相关蛋白LC3-Ⅱ及凋亡相关因子cleaved-caspase3变化趋势。(9)利用免疫荧光及western-blot等技术在不同处理的体外培养的小鼠耳蜗基底膜检测NLRX1表达,ROS水平,自噬活性及cleaved caspase3表达情况。结果(1)顺铂促进HEI-OC1细胞LC3-Ⅱ及NLRX1表达:顺铂促进LC3-Ⅱ表达并呈现浓度依赖性特点,与NLRX1表达成正相关关系,与细胞活力成负相关关系。(2)NLRX1促进HEI-OC1细胞自噬小体聚集:免疫荧光及透射电镜结果显示NLRX1过表达促进HEI-OC1细胞中自噬小体聚集。(3)NLRX1对顺铂诱导HEI-OC1细胞自噬和细胞毒性的作用:NLRX1沉默减弱顺铂诱导的自噬小体聚集及细胞毒性,NLRX1过表达促进顺铂诱导的自噬小体聚集及加剧顺铂细胞毒性。(4)NLRX1过度表达改变线粒体形态,并促进顺铂诱导的细胞内ROS的产生:NLRX1过表达导致线粒体肿胀,线粒体嵴减少及断裂,增加顺铂诱导的ROS产生。(5)抑制ROS可以明显减弱顺铂诱导的HEI-OC1细胞自噬和凋亡,减轻顺铂诱导的细胞毒性。(6)顺铂促进体外培养耳蜗基底膜中NLRX1表达及ROS产生,抑制ROS减轻顺铂引起的听细胞损伤。(7)抑制ROS明显减弱顺怕处理的基底膜中的细胞自噬和细胞凋广。结论:本研究表明NLRX1活性的增强促进HEI-OC1细胞自噬发生,导致线粒体异常并促进顺铂诱导的ROS生成,NLRX1介导的自噬可能通过促进顺铂引起自噬性死亡加剧耳毒性,本研究为拓宽我们对药物引起的毒性机制的认识提供了新的理论基础。
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实验结果逡逑１．邋ＮＬＲＸ１在ＨＥＩ－ＯＣ１细胞中表达状况逡逑由于目前还不清楚ＮＬＲＸ１是否表达于ＨＥＩ－０Ｃ１细胞，因此，本研究首逡逑先通过免疫荧光法探索ＮＬＲＸ１在ＨＥＩ－０Ｃ１细胞中的基本表达状况。我们在逡逑ＨＥＩ－０Ｃ１细胞的胞质中观察到ＮＬＲＸ１邋（绿色染色）呈点状表达，并且可以逡逑与线粒体标记物Ｍｉｔｏｔｒａｋｅｒ共染（图ｌａ），说明ＮＬＲＸ１表达于线粒体，并逡逑且本实验结果与之前有关ＮＬＲＸ１在其它细胞表达于线粒体的报道相一致。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ邋也证实邋ＮＬＲＸ１邋在邋ＨＥＩ－ＯＣ１邋细胞中的表达（图］ｂ）。ＨＥＫ－２９３Ｔ逡逑细胞作为ＮＬＲＸ１表达的阳性对照，亦观察到ＮＬＲＸ１的表达。这些研宄结逡逑果，为我们随后在体外听细胞系中研究ＮＬＲＸ１的作用机制提供了必要的基逡逑础。逡逑

２．顺铂诱导ＨＥＩ－ＯＣ１细胞凋亡引起细胞损伤逡逑ＭＴＴ实验证实，顺铂诱导的细胞毒性呈现浓度和时间依赖性，随着顺铀作逡逑用浓度的增加以及作用时间的延长，ＨＥＩ－０Ｃ１细胞活力逐渐下降（图２Ａ，逡逑２Ｂ）。在３０｜ｉＭ顺铀处理２４小时后，细胞活力降低至５３．４±４．９５５％，，后续实验逡逑中我们将选择该浓度对细胞进行处理。ＴＵＮＥＬ法检测的细胞凋亡结果显示，逡逑顺铂处理组的ＴＵＮＥＬ阳性细胞明显多于对照组（图３Ａ）。此外，流式细胞术逡逑检测Ａｎｎｅｘｉｎ邋Ｖ邋／邋ＰＩ双染色细胞结果显示，顺铂处理组凋亡细胞的比例显著高于逡逑对相应的对照组（图３Ｂ）。这些数据证实顺铂主要通过诱导ＨＥＩ－０Ｃ１细胞凋逡逑亡来发挥其耳毒性作用。逡逑＾逦１５０－１逦＾逦１５０－逡逑系邋１００－厂＊￣！逦＾邋１００－邋—Ｌ－１逦＿逡逑１逦广Ｉ

本文编号：2676765